Антитела конъюгация с ферментом

Иммуноферментный анализ. Метод широко внедрен в лабораторную практику в последнее время. В основе метода— использование антител, меченных ферментами (чаще всего пероксидазой). Конъюгацию осуществляют глутаровым альдегидом или другим бифункциональным реагентом. Реакцию проводят в условиях, исключающих инактивацию фермента. Техника постановки реакции состоит в следующем. Антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола. Если антитела, меченные ферментом, направлены к адсорбированному антигену, они окажутся фиксированными в лунках. Затем в лунки вносят раствор субстрата (если к антителам присоединена пероксидаза, то это перекись водорода и индикатор — диаминобензидин). В результате ферментативного превращения субстрата появится цветной продукт. Степень окраски пропорциональна количеству сорбированных антител с ферментом. [c.263]

В гл. 2. Технология конъюгации антител с ферментами (например, пероксидазой хрена, ПХ) описана в кн. 2. Существуют коммерческие препараты конъюгированных с ПХ антител к иммуноглобулинам различных видов животных (см. приложение). На рис. 6.17 приведены результаты Вестерн-блоттинга, полученные при использовании иммуноферментного метода. [c.233]

Рис. 12-4. Конъюгация антител с том. Окисленные углеводные (—СН-О) фермента взаимодействуют аминогруппами IgG.

Наиболее широко распространенными ферментами, используемыми для конъюгации со вторичными антителами, являются пероксидаза хрена и ш елочная фосфатаза. Пероксидаза хрена - первый фермент, использованный для иммунологического выявления при иммуноблоттинге. Преимуш ествами данной системы является относительная дешевизна как ферментного конъюгата, так и субстратов, используемых для развития окраски. В то же время чувствительность данной системы ниже, чем у других, используемых в настояш ее время систем. К тому же окрашенные [c.67]

После реакции антиген — антитело локализацию антигена устанавливают по активности связанного фермента. Использование пероксидазы в качестве ферментной метки имеет два решающих преимущества 1) фермент выпускается промышленностью в сравнительно чистом виде 2) для его выявления разработаны надежные гистохимические методы на световом и электронно-микроскопическом уровнях. Успех реакции определяется высокой удельной активностью антитела и чистотой ферментного препарата. Для конъюгации антител с ферментом используют различные реагенты. Помимо функционального реагента—и, п -дифтор-л ,л< -динитроли нилсульфона, который не оказывает существшного воздействия ни на ментативную, ни на иммунологическую активность, важное значение, по-видимому, имеет также глутаральдегид, поскольку и он не [c.302]

В настоящей главе обсуждаются факторы, которые необходимо контролировать, чтобы обеспечить достаточную чувствительность и надежность метода ELISA, ряд методик иммобилизации антител на различных твердых носителях и подходы к конъюгации ферментов с антителами или гаптенами. Будет также рассмотрено значение некоторых варьируемых параметров процесса, в том числе концентрации конъюгата и времени инкубации. [c.174]

Рис. 12-3. Конъюгация антител с ферментом. Для образования сшивки между аминогруппами IgG (белок 1) и сульфгидрильными группами фермента (белок 2) используют N-гидроксисукцинимидный эфир л-малеимидобеизойной кислоты.

Недавно описан мягкий метод конъюгации ферментов с антителами, обеспечивающий почти полное сохранение активности обоих партнеров [O Sullivan et al., 1979]. Он открывает дополнительные возможности для постановки иммунохимических экспериментов описанного выше типа в тех случаях, когда радиоактивно меченные вторичные антитела нужной специфичности отсутствуют в продаже или плохо переносят реакции иодирования. [c.294]

Очень перспективным методом очистки воды от всевозможных загрязняющих ее веществ, особенно синтетических, является использование иммобилизованных (закрепленных, нерастворимых) ферментов — ферментов второго поколения . Идея закрепления ферментов на нерастворимом в воде носителе и применения таких мощных катализаторов в технологических процессах и медицине возникла давно. Еще в 1916 г. осуществлена адсорбция инвертазы на активированном угле в свежевыделенной гидроокиси алюминия. С 1951 г. для фракционирования антител и выделения антигенов используют конъюгацию белков с целлюлозой. До недавнего времени существовал единственный метод закрепления ферментов — обыкновенная физическая адсорбция. Однако адсорбционная емкость известных материалов относительно белков явно недостаточна, а силы адгезии невелики, и разрыв связи между ферментом и поверхностью адсорбента может наступать от малейших изменений условий процесса. Поэтому такой метод иммобилизации не нашел широкого применения, но, поскольку он прост и может, по-видимому, способствовать выяснению механизма действия ферментов в живых системах, илах и почве, а в некоторых случаях применяться на практике, некоторые исследователи занимаются изучением адсорбции ферментов, поиском новых, эффективных носителей и т. д. [104, 206]. [c.176]

В случае ИФА кортизола для конъюгации гаптена с сульфгидрильными группами -галактозидазы были синтезированы производные кортизола — КГС-МБ и К-МБ. С целью сравнения нашего метода конъюгации с разработанными ранее мы проводили также связывание КГС с аминогруппами -ra-лактозидазы методом смешанных ангидридов. Сравнение полученных конъюгатов проводили методом осаждения вторыми антителами при избытке антител против кортизола. Установлено, что при использовании метода смешанных ангидридов метится только 40% молекул фермента, при этом ферментативная активность снижается на 20%. При использовании разработанного нами метода конъюгации с производными гаптена без заметного снижения ферментативной активности метится более 95% фермента (табл. 17-1). Число молей КГС-МБ или К-МБ, связанных с ферментом, непосредственно не определяли. Однако, как и в случае конъюгата [Т4 — фермент], можно счн тать, что с каждой. молекулой -галактозидазы связывается до 12 молекул гаптена. Изучали также иммунологическую активность и специфичность взаимодействия конъюгатов [гаптен — фермент] с антисывороткой против кортизола. Конъюгаты типа [КГС— ,-гaлaктoзидaзa] и [КГС-МБ— -гаЛактозидаза] обладают высокой иммунологической активностью, но лишь в незначительной степени вытесняются из комплекса с антителами [c.271]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология