Константа взаимодействия комплекса фермент—ингибитор

Поразительная специфичность действия ферментов привела к созданию теории замка и ключа, согласно которой для протекания реакции необходимо точное структурное соответствие между субстратом и активным центром фермента. Проведенные эксперименты убедительно доказали адекватность этой идеи, однако сама теория претерпела существенное изменение. Считается, что если фермент — это замок , а субстрат — ключ , то введение ключа в замок часто индуцирует конформационные изменения в молекуле белка. Имеется множество работ, в которых показано, что фермент укладывается вокруг субстрата, обеспечивая более точное соответствие подгоняемых структур. В пользу этого говорят данные по изменению спектров кругового дихроизма, спектров поглощения в УФ-области и констант седиментации, а также результаты исследования структуры комплексов ферментов с ингибиторами методом рентгеноструктурного анализа. Как мы уже видели ранее (гл. 4, разд. Д, I), идея индуцированного соответствия оказывается весьма плодотворной и при обсуждении взаимодействий субъединиц. [c.42]

Взаимодействие между трипсином и овомукоидом в отсутствие субстрата фермента протекает слишком быстро, поэтому непосредственные измерения сделать нельзя, но константа диссоциации комплекса была измерена и равна приблизительно 5-10 М. В том случае, если карбоксильные группы овомукоида блокированы этерификацией или аминогруппы трипсина ацетилированы, образование комплекса резко замедляется [62—64]. Диссоциация комплекса на его компоненты при значениях pH ниже 3 [65, 61] должна наводить на мысль, что ионизация карбоксильных групп фермента или ингибитора или обоих компонентов является основным условием для [c.36]

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. 4. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [c.19]

При исследовании обратимых ингибиторов определение зависимости константы ингибитора (константы диссоциации комплекса фермент — ингибитор Кд от температуры позволяет рассчитать А/ , АЯ и А5 для взаимодействия ингибитора с ферментом. При этом используются те же уравнения термодинамики, которые применяются для анализа реакции с субстратом. Таким образом, для реакции образования комплекса Е1 [c.135]

В случае фермента химотрипсина в качестве конкурентных ингибиторов часто выступают оптические антиподы асимметрических субстратов. Разница между оптическими изомерами подразумевает взаимодействие между ферментом и субстратом в трех точках, как это изображено схематически на рис. 123, на котором группы Р и р субстрата присоединены к поверхности молекулы фермента группами А и В, а па чувствительную связь К воздействует группа С. В случае оптического антипода субстрата взаимодействующие группы Р и Q точно так же могут быть соединены с группами А и В, однако группа В теперь слишком далеко удалена от воздействующей на нее функциональной группы С. Согласно этой модели, можно было ожидать, что константы диссоциации комплексов фермент-субстрат и фермент-ингибитор почти одинаковы. Поскольку экспериментально доказано, что константы диссоциации многих комплексов фермент-ингибитор соответствуют значениям субстрата, в этом случае можно [c.326]

При таком механизме процесса ингибирующее влияние продуктов реакции может рассматриваться как частный случай действия конкурентных обратимых ингибиторов. Следовательно, и количественная оценка ингибирующего действия продуктов реакции может быть дана на основе измерения константы диссоциации комплекса продукт — фермент (ее можно, по аналогии с константой ингибитора назвать константой продукта). Не исключено, однако, что продукт ферментативной реакции имеет возможность взаимодействовать, помимо того, с функциональными группами вне активного центра и, таким образом, влиять на активность фермента по принципу неконкурентного ингибитора. [c.99]

В последнее время рядом авторов выведены более общие уравнения, связывающие стационарную скорость ферментативной реакции с концентрациями реагирующих веществ и кинетическими константами, характеризующими взаимодействие ингибитора с ферментом и фермент-субстратными комплексами на разных стадиях их превращения [2,3]. [c.90]

В соответствии с моделью (4) АТФ способна образовывать фер-мент-субстратный комплекс только после диссоциации ингибитора (АДФ). В случае (5) АТФ взаимодействует с фермент-ингибитор-ным комплексом, в результате чгго происходит отщепление ингибитора с образованием активного интермедиата АТФазной реакции. Следует подчеркнуть, что если первая схема требует участия в процессе активации единственного места связывания для нуклеотида (фермент связывает либо АДФ, либо АТФ), то для осуществления реакции (5) необходимо существование по крайней мере двух мест связывания нуклеотидов молекулой фермента. Как было отмечено выше, структурных ограничений для рассмотрения обеих возможностей не существует (р1 способен связывать до 6 нуклеотидов на молекулу" фермента). Схемы (4) и (5) можно различить кинетически, по зависимости кажущейся константы скорости активации фермента (Анаб) от концентрации АТФ. [c.32]

Томас [97, 98] и Рафтери с сотр. [99—102] наблюдали уширение линий и изменение химических сдвигов сигналов метильных групп ацетамидных фрагментов этих ингибиторов и субстратов в присутствии лизоцима. Рафтери и сотр. изучили взаимодействие АГА, (АГА) 2, (АГА)з и (АГА) 4, а также а- и Р-метилглюкозидов с лизоцимом. Устанавливается равновесие Е+5 Е5, где Е и 5 — фермент и субстрат (ингибитор) соответственно, а Е8 — образованный ими комплекс. Константы диссоциации комплексов /Сз известны. Считается, что обмен свободных и связанных молекул происходит достаточно быстро. Поэтому наблюдаемый сигнал является усредненным. Его положение и полуширина — это средневзвешенные значения химических сдвигов и полуширин линий для обоих окружений в соответствии с молярным соотношением субстрат/фермент, которое всегда было не меньше 4. Однако в некоторых случаях приближение быстрого обмена не выполняется. Обмен оказывается слишком медленным, и его скорость зависит от pH и температуры. В частности, примечательно, что при медленном обмене сигнал ацетамидо-группы сильно уширен за счет не связанного с молекулярным движением вклада в кажущееся значение Тг. [c.389]

Шульман н сотр. [ИЗ—115] исследовали активный центр карбоксипептидазы А путем измерения релаксации малых молекул, связанных с этим ферментом. Карбоксипептидаза является протео-литическим металлсодержащим ферментом, который катализирует расщепление С-концевой пептидной связи в пептидах и белках. Она имеет молекулярную массу 34600 и содержит 1 атом цинка на молекулу, который обусловливает каталитическую активность, но фермент остается активным при замене 20 + на ионы Мп + или Со2+ [116]. Кристаллическая структура фермента известна [117, 118]. С атомом металла координированы три белковых лиганда, и имеются свободные положения по меньшей мере еще для двух лигандов. Связывание растворителя (НгО) [ИЗ], ингибиторов [114] или фторид-иона [115] на активном центре Мп2+-фермента влияет на релаксацию связанных ядер не только потому, что белок имеет длинное время корреляции, но также вследствие наличия парамагнитного иона металла. Уширение резонансных сигналов растворителя было объяснено тем, что одна молекула воды связывается с ионом Мп2+. Как следует из измерения уширения пиков метильных или метиленовых протонов конкурирующих ингибиторов — индо-лилуксусной, г/7ег-бутилуксусной, бромуксусной и метоюсиуксус-ной кислот — и одновременного определения времен корреляции взаимодействия протонов ингибитора с металлом, релаксация определяется главным образом временем обмена комплекса белок — ингибитор. Используя известные константы Михаэлиса — Ментен и эти данные, можно определить константы скорости всех отдельных стадий реакции фермента с субстратом. [c.393]

Из уравнения (XXI.17) следует, что присутствие конкурентных ингибиторов не влияет на ит=МЕ ]- Этого результата можно было ожидать, так как ясно, что при достаточно высоких концентрациях субстрата взаимодействие фермента с ингибитором окажется подавленным. Конкурентный ингибитор не изменяет кинетических констант. Его действие сводится к уменьшению концентрации активного фермента, поскольку молекулы фермента, находяшиеся в комплексе с ингибитором, не могут взаимодействовать с субстратом. [c.391]

Растворы уреазы (25 нМ) в воде (pH 6) обрабатывали ВЧ-ультразвуком в течение 1.5-2 ч при температуре 56°С в присутствии возрастаюшдх концентраций полимерного антиоксиданта по-ли(ДСГ) в диапазоне от l( до 10- М. В табл. 5 представлены константы скорости инактивации уреазы ин и ку в поле УЗ-кавитации в присутствии поли(ДСГ). Величины и уз снижаются в 2 и 3 раза в присутствии 1.0 нМ поли(ДСГ), т.е. полимерный антиоксидант сильно тормозит УЗ-инактивацию уреазы в присутствии ингибитора в концентрации, которая в 25 раз ниже концентрации белка. Увеличение концентрации по-ли(ДСГ) в пределах 10- -10- М вызывает рост всех трех констант скорости инактивации уреазы пропорционально содержанию ингибитора, что связано с его непосредственным взаимодействием с ферментом. В нашей лаборатории показано, что поли(ДСГ) в воде представляет собой полиэлектролит [30], способный взаимодействовать с белками - амфолитами, что подтверждено на примере сывороточных альбуминов человека и быка методами разностной спектрофотометрии и флуориметрии [31]. Прочные нековалентные комплексы поли(ДСГ) с уреазой характеризуются снижением активности фермента в них в условиях УЗ-кавитации (повышение уз и ) и при [c.129]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

В последнее время появилась возможность изучать физические свойства белков такими методами, как температурный скачок, которые позволяют исследовать процессы с временами, соизмеримыми с временами каталитического превращения субстрата на ферменте, так что стало возможным непосредственно установить взаимосвязь между скоростями субстратзависи-мых конформационных изменений и скоростями самой реакции. В настоящее время имеется ун е несколько свидетельств в пользу существования изомеризации ферментов и ферментсубстратных комплексов, которые могут представлять собой конформационные изменения такого рода [49—52]. Скорость мономолекулярной изомеризации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы характеризуется константой порядка 1 с и является слишком медленной, чтобы этот процесс имел место при каждом обороте фермента по-видимому, этот процесс относится к явлениям контроля ферментативной активности. Рентгеноструктурный анализ лизоцима [28], химотрипсина [54] и карбоксипептидазы [55] дал прямое доказательство существования изменений в конформации фермента при взаимодействии с субстратами или ингибиторами. Гемоглобин, хотя и не является ферментом, но может быть поучительным примером использования всех этих методов для демонстрации конформационных изменений при взаимодействии этого белка с кислородом [56]. [c.243]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология