Антитела, локализация

Сейчас проводится много экспериментов с использованием реагентов, образующих поперечные связи между белковыми молекулами. В частности, используются бифункциональные соединения, способные ковалентно связываться с двумя различными —SH- или —ЫНг-груп-пами [93—95]. Использование этого подхода дало возможность идентифицировать следующие связанные поперечными связями пары [93, 95] S2-S3, S4-S6, S4-S8, S4-S9, S4-S12, S5-S8, S5-S9, S7-S8, S7-S9, S11-S18, S13-S19 и S18-S21. Другой подход состоит в том, чтобы получать специфические антитела к отдельным рибосомным белкам и изучать при помощи электронного микроскопа места их связывания на поверхности рибосомных субчастиц [96, 97]. Этим методом была установлена локализация многих белков на поверхности как 30S-, так и 505-субчастиц (рис. 15-13). В ряде случаев антитела к определенному белку связывались сразу в нескольких участках. Тот факт, что связывающие места для антител к белкам S2, S12, S15 и S18 отстоят друг от друга на 8—19 нм, свидетельствует о том, что эти белки в 305-субчастице находятся в вытянутой, фибриллярной [c.230]

Один метод локализации со специфической физиологической активностью был позаимствован нз ПЭМ. Этот метод меток поверхности клетки, который, будучи применен к образцам для РЭМ, приводит к образованию на поверхности клетки морфологически различаемых или аналитически идентифицируемых структур. Такие методики в сочетании с растровой электронной микроскопией высокого разрешения позволяют изучать природу, распределение и динамические свойства антигенных и рецепторных состояний на поверхности клеткн. Методы нанесения меток на поверхность клетки в общем случае достаточно сложны и включают процедуры иммунохимической и биохимической очистки. Подробные ссылки на них можно найти в работах [359—361], но сущность методик состоит в следующем. Для крепления антител в определенных антигенных состояниях на поверхности клетки используются стандартные иммунологические процедуры. Хитрость состоит в том, чтобы модифицировать антитела таким образом, чтобы они также несли морфологически различимую метку, такую, как латексные шарики или сферы из двуокиси кремния, распознаваемый вирус, как, например, вирус табачной мозаики, или один из Т-четных фагов, как показано на рис. 11.18, илн белковая молекула известных размеров, как ферритин или гемоцианин. В работе [362] (рис. 11.19) использовались гранулы золота, которые имеют большой коэффициент вторичной электронной эмиссии. Одна часть антитела имеет средство для специфичного антигенного закрепления на поверхности клетки, в то время как другая часть несет морфологически различимые структуры. В настоящее время иммунологические методы достигли такого уровня, когда они не могут быть использованы для изучения как качественных, так и количественных характеристик поверхности клетки [363, 364]. [c.244]

Эти методы основаны на специфичности антител при выявлении на срезах тканей клеток локализации антигенного белка среди всех других белков. Для идентификации антител в местах их специфического связывания антитела метили флюоресцентны- [c.105]

С 1960-х годов и особенно в 80-е годы для проведений фундаментальных исследований по растительным белкам вер больше используются специфические антитела. Иммунохимические методы использовались при изучении белков с различными функциональными свойствами, таких, как ферменты, изо-ферментные компоненты, ингибиторы протеаз, лектины, запасные белки. Эти методы применялись при решении задач идентификации белков, определения их содержания, очистки, локализации в тканях, клетках и клеточных структурах, а также энзиматической регуляции. Они использовались в исследованиях по физиологии, патологии, биохимии, генетике и молекулярной биологии растений. Очень многие работы в этой области нашли отражение во множестве обзорных статей [12, 21—23, 26, 29, 35, 50, 57, 79, 83, 96]. [c.112]

Главное внимание исследователей было сосредоточено на попытках локализовать методом иммунной электронной микроскопии белки 30S субчастицы Е. соИ. Однако, несмотря на возможность получения специфических антител ко всем 21 индивидуальным белкам, эта задача оказалась не простой, и метод дал много ложных локализаций. Дело в том, что этот метод, кажущийся столь прямым и демонстративным, таит опасности различных артефактов, обусловленных недостаточной очисткой антител, неспецифическим присоединением антител к некоторым участкам поверхности частиц, искажением специфического положения антитела на частице вследствие ее ориентации на подложке и т. д. Тем не менее, в настоящее время можно выделить наиболее надежные результаты в отнощении 30S субчастицы. Первой такой надежной локализацией было, по-видимому, определение положения белка S14 на головке частицы (рис. 65) антигенный детерминант белка был найден на поверхности головки со стороны, противоположной боковому выступу ( платформе ) 30S субчастицы (рис. 68). Недалеко от него были локализованы также антигенные детерминанты белков S10 и S19. Ниже этой группы белков, в районе борозды, разделяющей головку и тело, был локализован белок S3, а еще ниже, близко к борозде, но уже на теле субчастицы, белок S5 (рис. 68). Белки S6 и S11 были локализованы по другую сторону 30S субчастицы, а именно на ее боковом выступе ( платформе ). Белок S8, согласно иммунной электронной микроскопии, располагается также у бокового выступа, где-то между ним и телом, на внешней (обращенной от 50S субчастицы) стороне 30S субчастицы. [c.112]

Первоначально иа основании анализа профиля гидрофобности полипептидных цепей холинорецептора было предположено, что каждая субъединица имеет по четыре трансмембранных фрагмента, а N- и С-концевые участки белков расположены снаружи постсинаптической мембраны. Однако с помощью антител против синтетических пептидов, соответствующих С-концевым областям различных субъединиц, удалось доказать локализацию С-концевого фрагмента на цитоплазматической стороне мембраны, вследствие чего субъединицы холинорецептора должны иметь по крайней мере по пять трансмембранных сегментов. [c.630]

Высокая специфичность антител по отношению к антигену делает их гибким и действенным инструментом, который можно использовать для выявления, количественного определения и локализации множества разнообразных веществ, представляющих интерес для биолога. Но как можно обнаружить или измерить взаимодействие антитела с антигеном Начальная реакция связывания антигена с антителом-так называемая первичная реакция-может быть измерена многими различными способами. При радиоиммунном анализе, позволяющем определять даже ничтожные количества материала, известное количество радиоактивного антигена вместе со стандартным количеством антител добавляют к образцу, содержащему неизвестное количество того же антигена в нерадиоактивной форме. Немеченый антиген конкурирует с меченым за связывающие участки антител, и чем больше данного антигена в образце, тем меньше радиоактивного антигена будет связано с антителом. Свободный радиоактивный антиген можно отделить от связанного, а затем измерить количество того и другого с помощью ряда методов, использующих различия в свойствах свободных и связанных молекул один нз общих подходов состоит в осаждении (преципитации) комплексов антиген-антитело антителами к иммуноглобулинам (рнс. 17-28). [c.27]

Для Б, с. характерна локализация на поверхности клетки. Они выполняют специфич. биологич. функции, связанные с процессами межклеточного взаимодействия. Так, способность бактериофагов поражать одни виды бактерий и не взаимодействовать с другими видами определяется специфич. строением поверхностного антитела бактерий, являющегося липополисахаридом от структуры поверхностных антигенов зависит и патогенность тех пли иных бактерий. Подобные же взаимодействия с участием Б. с. происходят, по-видимому, и при других биологич. процессах, в к-рых клетки узнают друг друга, напр. при оплодотворении, соединении клеток в ткани и клеточной дифференцировке. [c.130]

На новую высшую ступень люминесцентная цитохимия была поднята Кунсом с сотрудниками [4], разработавшими метод люминесцентно-меченых антител. В основном он заключается в следующем. В результате иммунизации животного соответствующим антигеном получают специфическую сыворотку белковые их фракции, в которых преимущественно сосредоточены специфические антитела, обрабатывают флуорохромом и получают комплекс флуорохром — антитело, используемый для обнаружения соответствующего антигена. Наличие и локализация последнего в микроскопическом препарате выявляется в результате реакции антиген — антитело. Продукт этой реакции ярко люминесцирует и с помощью люминесцентного микроскопа может быть открыт даже в отдельных участках клеток [18, 14]. [c.317]

Люминесцентно-иммунохимические методы дают возможность определять локализацию в клетках и изучать динамику образования антител. Так как получение люминесцентно-меченых антигенов трудно осуществимо (антигены принадлежат к разнообразным классам химических веществ), были предложены непрямые методы выявления антител [4, 15, 16]. Одним из таких методов является следующий. Препарат, содержащий искомое антитело, обрабатывается соответствующим немеченым антигеном после того как произойдет образование комплекса антитело — антиген, этот же препарат обрабатывается люминесцирующим антителом, специфичным по отношению к данному антигену. Образующийся при этом тройной комплекс легко выявляется благодаря интенсивной люминесценции. [c.317]

Реакции с люминесцентно-меченым белком, в особенности специфическими белками — антителами, отличаясь высокой специфичностью, позволяют проводить тончайшие цито-иммунохимические исследования с точной локализацией биологически важных веществ и процессов. [c.317]

Области применения методики флуоресцентных антител крайне многочисленны, поэтому приводим лишь некоторые примеры а) локализация антигенов в тканях, в том числе выявление антигенов пневмококков, риккетсий и патогенных вирусов б) специфическое выявление микроорганизмов (серологическая идентификация) в) выявление специфических антител в тканях и жидкостях организма г) локализация гормонов в клетках разных органов и тонкая локализация. [c.292]

Классические методы микроскопии позволяют судить о клеточной архитектуре, но не дают подробной информации о клеточной химии Мы уже говорили о том, что для локализации в клетках специфических макромолекул можно использовать антитела. Но столь же важно знать распределение и концентрацию малых молекул. Поддержание жизни возможно только при быстрой и точной регуляции концентрации таких важнейших метаболитов, как АТР, глюкоза и неорганические ионы содержание этих веществ в различных участках клеток и тканей может существенно варьировать. Более того, поскольку низкомолекулярные вещества, такие, как клеточный АТР, кальций и водород могут выполнять функцию внутриклеточных мессенджеров , очень важно уметь прослеживать изменение их концентрации в ответ на внутриклеточные сигналы В этом разделе мы будем обсуждать некоторые методы, заимствованные из химии, методы, которые позволяют определять химические условия в клетках в процессе их жизнедеятельности. [c.194]

В клетке можно пометить любые молекулы для этого е них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. [c.228]

После реакции антиген — антитело локализацию антигена устанавливают по активности связанного фермента. Использование пероксидазы в качестве ферментной метки имеет два решающих преимущества 1) фермент выпускается промышленностью в сравнительно чистом виде 2) для его выявления разработаны надежные гистохимические методы на световом и электронно-микроскопическом уровнях. Успех реакции определяется высокой удельной активностью антитела и чистотой ферментного препарата. Для конъюгации антител с ферментом используют различные реагенты. Помимо функционального реагента—и, п -дифтор-л ,л< -динитроли нилсульфона, который не оказывает существшного воздействия ни на ментативную, ни на иммунологическую активность, важное значение, по-видимому, имеет также глутаральдегид, поскольку и он не [c.302]

На иммунизацию организм отвечает синтезом очень неоднородной популяции антител, молекулы к-рых могут сильно отличаться друг от друга по сродству к антигену. Такая неоднородность объясняется участием в иммунном ответе очень большой популяции В-лимфоцитов, каждый из к-рых синтезирует лишь одну разновидность молекул антител. С помощью техники гибридом (гибридные клетки, получаемые слиянием злокачественных и нормальных анти-телобразующих клеток лимфоцитов) удается получить в больших кол-вах однородные моноклональные антитела, к-рые широко используют в качестве высокоспецифич. реагентов для обнаружения, локализации и выделения разл. в-в, а также для диагностики и лечения нек-рых заболеваний. Гомог. И. накапливаются в больших кол-вах в крови и моче больных при ряде злокачеств. поражений лимфоцитов (т. наз. миеломные И.). [c.217]

Большие усилия направляются на поиск нуклеаций — зародышей процесса свертывания, которые, как предполагают, служат основой дальнейшего свертывания. Такие зародышевые образования должны иметь исключительно стабильную структуру. Возможно, что их можно будет обнаружить с помощью антител или экспериментов с повторным свертыванием модифицированных белков. Локализация зародышей должна в большой мере ойаегчить моделирование свертывания. В любом случае очевидно, что понадобится еще очень большое число экспериментов, прежде чем загадка процесса свертывания будет разрешена. [c.196]

Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использующие две разные системы генов. В одном из них сочетаются G V-HSVi -терапия и генная иммунотерапия (рис. 21.12). Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном HSV/Л, другую -клонированной кДНК (или геном) одного из цитокинов. Цитокины (интерлейкин-2, интер-лейкин-12 и другие) играют роль сигнала, мобилизующего клетки иммунной системы и стимулирующего иммунный ответ. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помощью гена самоубийства , взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию. Кроме того, противоопухолевые антитела, поступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов. [c.503]

Весьма эффективным методом уточнения топографии мембранных белков, прежде всего точной локализации внемембранных участков, является использование моноклональных антител. Для получения гибридом использовались фрагменты бактериородопсина, полученные путем его расщепления протеолитическими ферментами. Наиболее ценными в этом случае оказались синтетические фрагменты коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, можно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже показана локализация различных антигенных детерминант молекулы бaктepиopoдoпtинa в пурпурной мембране (Г. Корана, И. Г. Абдулаев). [c.609]

Реакция встречного иммуноэлектрофореза (РВИЭФ). Эта реакция основана на встречной диффузии в электрическом поле антигенов и антител и появлении внутри прозрачного геля видимого преципитата. В агаровом или агарозном геле делают лунки диаметром 2 — 3 мм, причем расстояние между лунками для сыворотки и АГ должно составлять 5 — 6 мм. Лунки располагают попарно (одна — для АГ, вторая — для сыворотки) или по три (одна — для АГ, вторая — для испытуемой сыворотки, третья — для контрольной сыворотки). Лунки для сыворотки располагают ближе к аноду, а для АГ — к катоду. Реакцию проводят с несколькими разведениями АГ, продолжительность электрофореза — 90 мин. Результаты реакции учитывают сразу же после окончания электрофореза, отмечая количество и локализацию линий преципитации при сравнении их с контрольной тест-системой. [c.69]

Для выявления специфических молекул в клетках нли тканях и для опреде леиия их локализации можно использовать радиоактивные и флуоресцентны антитела, а также антитела, соединенные с ферментом. В этих случаях связанные антитела вдентифицируют с помощью радиоавтографии, флуорео центной микроскопии или по окрашенному продукту ферментативной peat-ции (см. гл. 4). [c.28]

Для научно-исследовательских и диагностических целей в вирусологии особый интерес представляют описанные нами выше методы с применением люминесцентно-меченых антител. Эти методы 120] уже позволили разрешить ряд сложных вопросов, касающихся внутриклеточной локализации и динамики развития вирусных скоплений в клетках. Они привели к разработке методов практического раснознавапия вирусных инфекций, в частности вируса гриппа [21], и исследования вируса полиомиелита [22]. [c.318]

Локализация пипиентов и переносчиков электронов в мембране. Некоторые сведения по этому вопросу были получены при исследовании функций тилакоидов в присутствии антител, а также липофильных или гидрофильных искусственных окислительно-восстановительных систем. Иммунные антитела, полученные против отдельных очищенных компонентов фотосинтетической электрон-транспортной системы, не в состоянии проникать сквозь мембрану и реагируют поэтому только с теми компонентами, которые расположены на наружной поверхности тилакоидов. Например, антитела к ферредоксину или к фeppeдoк ин-NADP-редуктазе эффективно подавляют функцию фотосистемы I значит, эти [c.388]

До сих пор в литературе отсутствуют какие-либо указания о локализации антител, выработанных на гипофизарные гормоны. Относительно локализации антител-иод-131 к фибрину группа Бейла в США получила многообещающие данные [96]. Дьюи исследовал распределение антител-иод-131 к фибрину на больных с опухолями саркомы и меланомы и отметил их преимущественную локализацию в этих опухолях [97]. [c.513]

Локализация антигенов в клетках тканей II. Усовершенствование метода обнаружения антигенов при помошр флуоресцирую-п их антител [c.47]

Пред,дагаемый метод заключается в том, что обрабатывают ткань раствором ф.дуоресцирующего антите.ла, которое фиксируется в месте образования соединения антиген-антитело. Под люминесцентным микроскопом локализация антигена обнаруживается по яркой ф.чуоресценции желто-зеленого цвета. [c.47]

Энзиматические и химические механизмы процессов некрозо-образования в настоящее время достаточно изучены. Некрозы возникают в результате действия химических соединений, образующихся как продукты искаженного обмена клетки, подвергшейся одному из видов повреждающих воздействий. Токсическое действие этих соединений (хиноны, аммиак и др.) направлено не только против возбудителя, но в равной мере против инфицированных и близлежащих тканей растения-хозяина. В этом можно усмотреть одно из ярких проявлений принципиальных отличий защитных реакций у растений от таковых у животных. В то время как у иммунных форм растений локализация инфекции за счет гибели некоторой части ткани знаменует собой возможность сохранения остальной части ткани органа и организма, у животных такого рода потери невозместимы. Этим и объясняется высокая степень специфичности защитных механизмов животных, выражением которой может служить, например, специфичность белковых антител. [c.332]

Развитие гистохимической техники позволило использовать антитела, специфичные по отношению к разным ферментам. Эти антитела метят либо флуоресцентными группами, с тем чтобы их можно было исследовать оптическими методами [3337], либо ферритином, что позволяет исследовать их в электронном микроскопе, либо же пероксидазой, которую можно затем определить гистохимически с помощью бензидина [5124]. По локализации конъюгированных антител судят о локализации исследуемого фермента. [c.86]

При использовании метода в иммунной электронной микроскопии получают антитела к индивидуальным рибосомным белкам. Этими антителами обрабатывают ин-тактные субчастицы и затем с помощью электронного микроскопа определяют места связывания. Таким способом была определена локализация всех белков 308-субча-стицы, а также многих белков 508-субчастицы. [c.107]

До недавнего времени изучение клеточных белков было ограничено лищь мажорными фракциями, т.е. белками, содержащимися в клетках в относительно больщом числе. С помощью обычных методов хроматографии и электрофореза из нескольких сот граммов клеточной массы можно получить примерно 0,1 г (100 мг) одного из мажорных белков, составляющих 1% или более от всего количества клеточных белков. Этой массы белка вполне достаточно для изучения его аминокислотной последовательности, детального анализа биологической или ферментативной (если таковая имеется) активности и получения антител, которые могут быть использованы для локализации белков в клетках. Более того, когда удается вырастить подходящие кристаллы, то с помощью рентгеноструктурного анализа можно установить трехмерную структуру молекулы. Именно таким образом была определена структура и функция многих распространенных белков, в том числе гемоглобина, трипсина, иммуноглобулина и лизоцима. [c.243]

Рис. 8-68. Компартментация аппарата Гольджи. По мерс продвижения сквозь тесно сгруппированные цистерны стопки Гольджи белки претерпевают ковалентные модификации. Транс-сеть Гольджи (ТОК) представляет собой трубчатый ретикулум, который работает прежде всего как ориентировочный пункт. Локализацию каждой изображенной здесь ступени пропессинга удалось определить, сочетая различные методы, включая субфракционирование мембран аппарата Г ольджи и электронную микроскопию после окраски антителами к некоторым ферментам процессинга.

Рис. 13-35. Эта электронная микpoфoтoqзaфия показывает, что протеинкиназа, кодируемая онкогеном -sr вируса саркомы Рауса, прикреплена к внутренней поверхности плазматической мембраны как полагают, белок sr , образующийся под действием белка -sr , по-видимому, находится там же, но его труднее обнаружить, так как он обычно присутствует в очень малых количествах Локализация белка sr была определена на этом препарате по его реакции со специфическими антителами, к которым были присоединены электроноплотные частицы

Справочник химика 21

Химия и химическая технология