Субклонирование

При повторном клонировании (субклонировании) набор вариантов уже значительно меньше, что позволяет сравнительно просто отыскать фрагмент с нужным геном. Часто для повторного клонирования используют и другой вектор, и другой (например, важный в практическом отношении) организм хозяина. [c.104]

Субклонирование из фага к в плазмидном векторе [c.52]

Субклонирование из фага Я, в плазмидном векторе 53 [c.53]

М 13-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК, содержащую нужную вставку, вьщеляют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют дидезокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250-350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвенируют следующие 250-350 нуклеотидов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклеотидную последовательность следующих 250—350 нуклеотидов (рис. 5.17). Эту процедуру, называемую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки. [c.93]

После идентификации токсинового гена В. thuringiensis бьша определена первичная структура кодируемого им белка. Сравнение аминокислотных последовательностей разных белковых токсинов показало, что белки некоторых штаммов имеют одинаковый домен, ответственный за токсичность. Кроме того, был субклонирован сегмент полной кодирующей последовательности, с которого синтезировался укороченный белок, в полной мере сохранивший свою токсичность. Таким образом, при последующих генноинженерных манипуляциях могут использоваться интактный ген токсина, его фрагмент или химически синтезированный олигонуклеотид. [c.336]

Рис. 20.27. Прогулка по хромосоме . А. Зонд 1 гибридизуют с клонированным фрагментом ДНК длиной 40 т. п. н. После субклонирования и построения рестрикционной карты последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся, используют для создания зонда 2. Б. При помощи зонда 2 из библиотеки выбирают другой клон (отличный от клона 1) и используют последовательность, дистальную по отношению к гибридизовавшейся с ним, для создания зонда 3. Клоны 1 и 2 вместе составляют примерно 80 т. п. н. (за вычетом перекрывающегося участка - зонд

Субклонирование (Suh loning) Перенос части уже клонированной молекулы ДНК в другой клонирующий вектор. [c.560]

В ранних исследованиях обнаружилось большое сходство с пигментным эпителием сетчатки. Дифференцированные хрящевые клетки-хоидроциты-растут в подходящей культуральной среде, образуя клоны дифференцированных хондроцитов, которые легко распознать, так как они синтезируют большие количества очень характерного хрящевого матрикса. Хрящевой фенотип сохраняется и при многократном субклонировании клеток, если они растут в благоприятных условиях Даже клетки, выращиваемые в течение многих поколений на не вполне подходящей среде, на которой они не могут синтезировать хрящевой матрикс, вновь обретают эту способность к синтезу, если их поместить в благоприятную для этого ( пермиссивную ) среду. [c.133]

Отобранный на одном этапе селекции мутант служит исходным для следующего этапа после такой же процедуры подготовки, какая была описана для исходной культуры (субклонирование на основе естественной изменчивости с построением контрольного вариационного ряда). Извеспгы случаи, когда субклонирование вновь полученного мутанта позволяло отобрать штамм с более высокой продуктивностью. [c.86]

Из приведенных примеров ясно, что состояние носительства объясняется длительным сосуществованием в одной популяции бактерий, инфицированных фагом и чувствительных пеинфициро-ванных бактерий. Популяцию бактерий, находящуюся в состоянии носительства, возможно очистить от фага, если делать пересевы в присутствии специфической антифаговой сыворотки, способной инактивировать как свободный фаг, так и фаг, освобождающийся из инфицированных бактерий, и тем самым предотвратить повторную инфекцию чувствительных бактерий. Выделение при повторных субклонированиях чувствительных клонов, свободных от фага, также свидетельствует, что исходная популяция находилась в состоянии носительства. [c.184]

Для субклонирования используется векторная плазмида рВК322. Этот вектор является Атр Те1 Выделяют ДНК этой плазмиды и проводят ее очистку равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым эти- [c.52]

Плазмида pBR322 — самая популярная плазмида, широко используемая для субклонирования фрагментов в клетках Е. o- [c.162]

Выделенные из дрожжей реплицированные линейные рекомбинантные молекулы (рис. 9.53, В) использовались в качестве векторов для клонирования самих теломер дрожжей. Один из необычных концов сначала удалили, расщепив дуплекс соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой (рис. 9.53,/1- К отрезанному концу пришили рестрици-рованную дрожжевую ДНК. После трансфекции были отобраны клетки, содержащие молекулы, которые реплицировались в дрожжевых клетках как стабильные линейные ДНК (рис. 9.53, Г). Функциональные дрожжевые теломеры, вьщеленные путем субклонирования, использовали для определения числа копий этих последовательностей в геноме дрожжей. Оказалось, что на гаплоидный геном приходится 30-40 таких копий именно столько, сколько и должно быть при условии, что гомологичные сегменты находятся на каждом из концов всех 16 хромосом дрожжей. [c.214]

Для клонирования и субклонирования Т-клеток каждой перевиваемой линии мы готовили ие менее 300 микрокультур. По данным большого числа экспериментов, в 5—40% микрокультур наблюдается рост клеток. Клонирование идет лучше всего, когда лимфоциты, растущие в присутствии антнгена и адгезивных клеток, перспосят в среду, дополненную ФРТК. [c.299]

Ж> Клонирование и субклонирование аллореактивных Т-клеток [c.309]

При субклонировании вставку рекомбинантной ДНК, выделенную из вектора изолированного клона, переносят в новый вектор, который дает возможность ее исследования в более простых условиях и с затратой меньших усилий. Если вставка была получена в фаговом, космидном векторе или с использованием искусственной хромосомы, что предполагает ее большой исходный размер, то она может быть переклонирована по частям в плазмидном векторе, и это может значительно облегчить ее дальнейшее исследование, например, с помощью секвенирования. [c.167]

Использование Qp-репликазы для амплификации нуклеотидных последовательностей. Этот способ амплификации осуществляется на уровне РНК с использованием РНК-репликазы, которая обычно участвует в репликации геномной РНК колифага Q(3 329]. Соответствующие РНК-матрицы могут быть получены субклонированием требуемых последовательностей в виде фрагментов ДНК, внедренных в последовательности Qp-ДНК под контроль промотора Т7-РНК-полимеразы в подходящем векторе. С помощью Т7-РНК-полимеразы на ДНК-матрице такого плазмидного вектора можно получать копии РНК, которые будут служить матрицами при синтезе РНК Qp-репликазой in vitro. При более общем подходе к реализации этих идей получают два РНК-зонда, которые гибридизуются с соседними последовательностями анализируемой РНК таким образом, что между ними остается одноцепочечный разрыв, который может быть ликвидирован с помощью Т4-ДНК-лигазы. Оба зонда по отдельности не могут реплицироваться Qp-репликазой, однако, после ковалентного соединения в составе объединенной молекулы становятся для нее хорошей матрицей (рис. 30). [c.248]

Субклонированную клеточную ДНК использовать для скрининга библиотеки геномной ДНК (и/или библиотеки кДНК), полученной от нормальных мышей. Эти клоны содержат в неизмененном виде интересующий ген. [c.497]

Но прежде чем перейти к подробному изложению, стоит еще немного задержаться на том что же, собственно, подразумевается под ПЦР-секвенированием ДНК . Так, в большинстве случаев метод ПЦР просто служит для получения в требуемых количествах определенного участка ДНК, намечаемого к секвенированию, что в некоторой степени заменяет молекулярное клонирование или субклонирование этих же фрагментов ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК непосредственно в ходе ПЦР в присутствии дидезокситерминаторов носит название циклического секвенирования и имеет свои особенности. Иногда трудно провести грань между этими [c.134]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология