Сайты рестрикции определение

Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов - при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов (дополнение 4.1). На рис. 4.4,А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью. Из этих данных следует, что данный участок ДНК имеет по два сайта для ВатШ и ЕсоШ. [c.53]

Рестриктазы представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и [c.25]

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями — палиндромами [c.26]

Затем следует построить карту ДНК. Для этого ДНК разрывают в определенных точках, расстояние между которыми можно точно измерить. Такие точные разрывы возможны благодаря рестриктирующим ферментам (ферменты рестрикции, рестриктазы), мишенью которых служат короткие специфические последовательности ДНК. Карта ДНК, полученная в результате локализации точек разрыва, называется рестрикционной картой. Она представляет собой линейную последовательность сайтов, в которых определенные рестриктирующие ферменты специфически узнают свои мишени. Расстояние между сайтами рестрикции измеряют прямо в нуклеотидных парах ДНК (сокращенно п. н. для коротких отрезков и т. (п.) н. тысяча (пар) нуклеотидов для длинных отрезков). [c.43]

Пример использования этого метода показан на рис. 3.1. Индивидуальную молекулу ДНК длиной 5000 п. п. обрабатывают отдельно двумя рестриктаза-ми-А и В. Разрезанные фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза. Можно видеть, что фермент А разрезал ДНК-субстрат на четыре фрагмента размером 2100, 1400, 1000 и 500 п. н., тогда как фермент В образовал три фрагмента размером 2500, 1300 и 1200 п. н. Можно ли на основании этих данных расположить сайты рестрикции в определенном порядке и построить рестрикционную карту [c.44]

Один из таких приемов заключается в неполном расщеплении. В определенных условиях эксперимента рестриктаза узнает и расщепляет не все свои мишени в каждой молекуле ДНК. Например (рис. 3.3), при частичном расщеплении ДНК ферментом А могут образоваться фрагменты 3100 п.н., 1400 п.н. и 500 п.н. Сопоставив их с тем, что получается после полного расщепления, можно сразу расположить фрагменты 2100 п.н. и 1100 п.н. рядом, как составляющие фрагмента 3100 п.н. Таким путем можно последовательно расположить сайты рестрикции одного фермента. При неполной рестрикции можно также получить фрагмент 3500 п. н. тогда можно расположить рядом фрагменты 2100 п.н. и 1400 п.н. [c.46]

Некоторые рестриктазы по отношению к сателлитной ДНК ведут себя иначе. При обработке этими ферментами образуются последовательности одного и того же размера. Но они расщепляют только небольшую часть ДНК, скажем 5-10%. Из этого следует, что повторяющиеся единицы, имеющие такой специфический сайт рестрикции, сосредоточены в определенном участке сателлитной ДНК. По-видимому, все группы повторов в этом домене произошли от родоначальной последовательности (утратили его в результате мутации). [c.306]

Используя метод Саузерна при сравнении нормальных мух и мух, в геноме которых имеются делеции, можно локализовать концы этих делеций, если использовать в качестве зонда клонируемую ДНК. О нарушении нормальной нуклеотидной последовательности в делетирован-ной хромосоме свидетельствует изменение распределения сайтов рестрикции по сравнению с ДНК нормальной хромосомы. Например, если конец делеции находится между двумя сайтами рестрикции нормальной ДНК, то расстояние между оставшимся сайтом и следующим (внутри делеции) изменится, поскольку почти наверняка следующий сайт в делеции окажется на другом расстоянии от сохранившегося, чем был первый. На рис. 9.18 показано использование метода Саузерна для определения нового распределения сайтов рестрикции. [c.283]

Подобный анализ можно провести и для многих других заболеваний. Обычно точковые мутации идентифицируют путем определения нуклеотидной последовательности изучаемого гена, но, если мутация затрагивает сайт рестрикции, для ее выявления достаточно рестрикционного анализа. Делеции и вставки ДНК-фрагментов больших чем 50 пар оснований определяют методом блоттинга по Саузерну. [c.48]

Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х — начале 1970-х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. restri ting — ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестрицируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрикционные эндонуклеазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, нуклеаза ) в строго определенных точках ( эндо означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отнощении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. [c.219]

A. Ваш коллега прав. Поскольку точка перекрещивания у всех молекул находится на одном и том же расстоянии от определенной последовательности (уникального сайта, узнаваемого рестриктазой), то последовательности, вовлекаемые в кроссинговер, должны быть гомологичными. Учитывая то, что они находятся на произвольных расстояниях от сайта рестрикции, можно считать, что не существует каких-либо предпочтительных сайтов для рекомбинации. [c.300]

Индивидуальная рестрицирующая нуклеаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами (рестриктами). Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрицирующих нуклеаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других рестрикционных участков (рис. 4-61) Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет приближенно оценить гомологию между ними. Отсюда следует, что можно проводить сравнение различных участков ДНК (сравнивая их рестрикционные [c.230]

Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/-, -/-) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке 1 можно использовать зонды, гибриди-зующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (НДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. [c.453]

Фаг X также представляет собой хороший пример того, как можно использовать фрагменты, образующиеся при рестрикции (рестрикты) для описания структуры генома вируса. На рис. 9.6 можно видеть число и размеры фрагментов ДНК, образующихся при действии нескольких различных рестриктаз на геном этого фага. Последовательность фрагментов, образующихся при действии определенной рестриктазы, можно определить с помощью сочетания нескольких методов, цель которых состоит в построении карты сайтов рестрикции генома фага X. На рис. 9.7 схематически изображена карта сайтов E o RI и Hin dlll на фоне генетической и физической карт генома фага X. [c.271]

Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) лиагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарущением какого-то одного гена. В больщинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в пени ДНК. кодирующей Р-пепь гемоглобина) В данном случае синтезируют два олигонуклеотида Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лищь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для больщинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. [c.241]

Одна из наиболее часто возникающих проблем при анализе биологических текстов - поиск гомологий. И это понятно, поскольку схожесть текстов позволяет делать выводы об их эволюционной и/или функциональной близости. Здесь можно привести пример обнаруженной гомологии между определенными типами онкогенов и клеточными генами (НаЬагго et а1., 1984), что привело к возникновению нового направления исследований. Гомологии между последовательностями часто используют для реконструкции эволюционных деревьев. Такие важные аспекты анализа биологических текстов, как поиск повторов, палиндромов, симметричных участков, сайтов рестрикции, также связаны с проблемой поиска гомологий. Анализ гомологий необходим также при подготовке и проведении целого ряда экспериментальных работ, в частности при синтезе олигонуклеотидных зондов для поиска клонов в клонотеке, стыковке фрагментов нуклеотидных последовательностей при секвенировании протяженных участков ДНК или целых геномов и др. [c.11]

Построение множественных физических карт. Уже в первых работах по физическому картированию было отмечено, что использование только информации о результатах двух одиночных и одной совместной рестрикции, как правило, не дает возможности однозначно восстановить физическую карту при числе сайтов около 10 ( по каждой рестриктазе) получаются десятки (а иногда сотни) карт, лежащих в пределах ошибок биохимического эксперимента ( Певзнер, Миронов,1987а). Причины этого кроются, с одной стороны, в недостаточно высокой точности определения размеров фрагментов, с другой - в огромном количестве вариантов взаимного расположения сайтов рестрикции. Для снятия неоднозначности приходится переходить от двух к нескольким рестриктазам ( известны случаи, когда использование даже 5 одиночных и 10 совместных рестрикций не давало возможности однозначно идентифицировать физическую карту). Таким образом, при переходе к нескольким рестриктазам вместо классической задачи построения парной физической карты (по двум SD- и одной DD- рестрикции) возникает задача построения множественной физической карты (по нескольким SD- и DD-рестрикциям), для решения которой предложен метод потенциалов (Певзнер,Миронов,1987а). В разделе 5.4 описывается метод потенциалов и обсуждаются трудности, возникающие при построения множественных физических карт. [c.159]

SPHJS THpoBaHHH больших геномов и построении подробных физичес-ких КМ.Т необходимо привлекать дополнительные методы. Мы рассмотрели методы физического картирования, основанные на анализе результатов одиночных и совместных рестрикций. При этом подходе экспериментальная работа сводится к минимуму, однако построение карты по такой косвенной информации вызывает большие математические трудности, которые не всегда удается преодолеть (при значительном числе сайтов рестрикции и ошибках в определении размеров фрагментов). Дополнительные биохимические эксперименты по картированию позволяют за счет дополнительной экспериментальной работы снять некоторые математические проблемы. Даже в тех случаях, когда математические проблемы удается преодолеть, при картировании больших геномов, как правило, возникает несколько физических карт, согласующихся с экспериментальной информацией - снять эту неоднозначность удается только при использовании дополнительных биохимических экспериментов. [c.186]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая различные типы прыжков по хромосоме , А — клоны стандартных библиотек, позволяющие осуществлять строго определенные прыжки, начиная от любой точки на хромосоме. Б — два клона специфических библиотек, в данном случае для фермента Они позволяют осуществлять прыжки от одного сайта этого фермента к ближайшему такому же сайту. В — клоны библиотек связок , представляющие собой участк ДНК, которые включают редко встречающиеся сайты рестрикции, в данном случае Л оЛ-сайты. Г — клоны стандартной библиотеки, позволяющие осуществлять прыжки от произвольной точки до ближайшего редкого сайта рестрикции, в данном случае тоже до Л оЛ-сайта.

Последовательности нуклеотидов липких концов, образующихся под действием рестриктаз типа IIS, являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной исходной последовательности, которая задается уникальными последовательностями нуклеотидов в липких концах рестрикционных фрагментов ДНК. Например, при расщеплении рестриктазой типа IIS репликативной формы ДНК фага фХ174 образуется 14 фрагментов, которые in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием инфекционной фХ 174-ДНК. [c.54]

При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами. [c.323]

Основные свойства. Для эффективного выполнения своей функции вектор должен отвечать определенным требованиям 1) быть репликоном, чтобы стабильно существовать в клетке 2) иметь селективный маркер, позволяющий отбирать трансформированные вектором клетки 3) иметь, по крайней мере, один единичный сайт рестрикции для внедрения в него чужДНК (подобные сайты будем в дальнейшем называть сайтами клонирования). Эти требования, конечно, не жесткие. Например, оп-сайты могут отсутствовать в интефативных векторах, а селективные маркеры — в фаговых. [c.191]

По данным сиквенса одной нити программы строят комплементарную нить, подсчитывают состав оснований, вьщеляют области, богатые ОС- или АТ-парами, представляют частоты встречаемости различных динуклеотидов, дают информацию о локализации специфических сайтов и т. д. Программы отыскивают прямые и инвертированные повторы в ДНК, причем можно задать степень негомологичности и длину стебля шпильки. Нетривиальные повторы могут служить регуляторными сайтами, образуя совместно с регуляторными белками и вспомогательными факторами характерные структуры в самой ДНК или в РНК-транскрипте. Анализ на наличие и локализацию сайтов рестрикции, информация о числе и размере рестриктов, образуемых действием одной несколькими рестриктазами, позволяют планировать эксперименты по клонированию определенных участков геномной ДНК. При этом программы учитывают форму ДНК (линейная или кольцевая). [c.470]

Смотреть страницы где упоминается термин Сайты рестрикции определение: [c.62] [c.453] [c.453] [c.388] [c.230] [c.142] [c.43] [c.127] [c.191] [c.294] [c.43] [c.187] [c.161] [c.48] [c.58] [c.152] [c.171] [c.291] [c.296] [c.186] [c.342] [c.219]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология