Аминокислоты, определение которых осложнено

Влияние pH на ферментативную активность иногда можно объяснить в рамках модели, предполагающей, что катализ зависит от состояния ионизации некоторых аминокислот. Тогда, если зависимость кат//См от pH описывается колоколообразной кривой, по ней можно определить константы ионизации Ки и К е каталитически важных групп в свободном ферменте. Константы ионизации, относящиеся к комплексу Е5, можно получить из зависимости кат от pH [101]. В случае КПА определение величин К е и Кге было бы полезным для установления роли тирозина и других остатков, расположенных вблизи субстрата. Однако имеющиеся данные довольно скудны. Пептидный субстрат КБЗ-01у-01у-РЬе был исследован недавно в условиях, при которых интерпретация результатов не осложняется ингибированием или активацией [7]. Кривые зависимости кат/-/См от pH оказались колоколообразными, что предполагает участие в катализе как кислой, так и основной групп. Кривые, описывающие влияние pH на кат, для этого субстрата имеют точку перегиба около pH 6. В щелочной области (до pH 10,5) кат практически постоянна . Отсутствие данных, указывающих на титрование второй группы в комплексе Е5, не исключает возможности участия в реакции кислотного катализа, если предположить, например, что соответствующая стадия не лимитирует скорость реакции (ср., однако, работу [103]). Зависимость гидролиза КГФ от pH представлена в нескольких ранних работах. Данные, полученные при высокой концентрации субстрата, указывают на с./южный характер влияния pH на кат и [26]. По зависимости начальной скорости от pH [104] были определены величины р/Се51 равные 6,5 и 8,6, однако сравнение с ацилтрипептидами показывает, что эти данные нуждаются в уточнении. При более низкой концентрации КГФ влияние pH на кат менее выражено [85]. [c.536]

При работе с карбоксипептидазами следует учитывать следующие основные проблемы. Во-первых, многие препараты панкреатических ферментов А и В содержат эндонуклеазы (трипсин, химотрипсин), которые следует инактивировать добавлением диизопропилфторофосфата (ДИФФ). Коммерчески доступны обработанные таким образом карбоксипептидазы А и В. Во-вторых, следует учитывать различие в скоростях отщепления отдельных аминокислот, зависящее не только от природы С-концевого остатка, но и от природы предпоследней аминокислоты, что может осложнить определение последовательности. Когда вслед за трудно отщепляемым остатком стоит легко отщепляемый, то скорости высвобождения этих двух аминокислот будут почти неразличимы. Еще одним осложнением является случай, когда в С-концевой последовательности стоят подряд несколько остатков одной аминокислоты. По всем вышеупомянутым причинам при использовании карбоксипептидаз обычно [c.508]

Отнесение резонансных линий к определенному типу аминокислот основывается на том, что в аминокислотных остатках большинство протонов связаны между собой косвенным спин-спиновым взаимодействием. В то же время спин-спиновое взаимодействие между протонами двух соседних аминокислот очень слабое, поскольку между ближайшими парами протонов На-протоном и амидным, имеются четыре связи (см. рис.3.3), т.е. каждый аминокислотый остаток протеина можно рассматривать как изолированную спиновую систему. Так что для каждой аминокислоты имеет место типичная картина спин-спинового взаимодействия, наблюдаемая в двумерных спектрах ЯМР. Рис.3.25 дает схематическое представление о косвенном спин-спиновом взаимодействии для валинового остатка, соответствующее методам OSY и R T. Такая же картина должна наблюдаться и в реальном экспериментальном спектре (рис.3.26). Интерпретация спектра осложняется не только тем, что неизвестны точные значения химических едвигов для искомых резонансных линий, но и тем, что не может быть проведено надежное отнесение отдельных кросс-пиков в спектре. Это может быть также связано и со слишком большой шириной резонансных линий кросс-пиков, так как уширение линий сопровождается также уменьшением их амплитуды, и часто рассматриваемые линии сливаются с фоном. Поскольку ширины линий, которые в основном определяются временем поперечной релаксации и скоростью химического обмена, заранее неизвестны, то отсутствует уверенность в том, что проведено правильное отнесение линий. Особенно существенно на отнесении линий сказывается ширина линий в спектрах, полученных по методу OSY, в которых пики в подспектре расщепляются на пики с отрицательными и положительными знаками, так что полный интеграл пиков кросс-мультиплета равен нулю. Чем больше ширины линий, тем менее заметны эти линии в спектре. Это проявляется тем нагляднее, чем ближе располож ены одна к другой линии различных знаков, что пршсходит в том сл уча е, [c.132]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология