Электрофорез в мягких условиях

В еще более мягких условиях протекает взаимодействие 4-тио-уридин-2 (3 )-фосфата с Ы-этил-малеинимидом 5 при pH 7,8 и 37 °С реакция в 0,003 М растворе реагента завершается за 3 ч. УФ-Спектры и данные электрофореза продукта реакции согласуются со структурой ХХУП (2-тиоуридин и его фосфаты не вступают в подобную реакцию). [c.429]

Вследствие этого с помощью фронтального метода изучались почти исключительно белки и некоторые другие нолиэлектролиты (например, нуклеиновые кислоты). Важным преимуществом при изучении таких лабильных веществ, как белки, является то, что исследование ведется в очень мягких условиях, при низкой температуре, определенных значениях pH и ионной силы, отсутствует опасность адсорбции и денатурации на поверхности твердой фазы, которой нелегко избежать при зональном электрофорезе (см. ниже). [c.62]

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В МЯГКИХ УСЛОВИЯХ [c.126]

В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях (без ДДС-Ма или мочевины) не сказывается на их активности. Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с помощью специфических реакций, дающих окрашенные продукты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофакторов, необходимых для протекания определенной ферментативной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует, его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продвижением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять, каково будет поведение субстрата в электрическом поле во время электрофореза. [c.101]

Для гиалуроновой кислоты Огстон и сотр. [30—32] получили данные, свидетельствующие о том, что гиалуроновая кислота из синовиальной жидкости быка представляет собой комплекс с белком, содержание которого равно 26—30%. При выделении в мягких условиях (дифференциальное фильтрование, использование хлористого цетилпиридиния) гиалуроновую кислоту не удается освободить от этого белка. Белок не отделяется и при электродиализе. Огстон и Шерман [33] сообщили, что электродиализ синовиальной жидкости быка при 37 ма (5,6 ма/см , 0,025 М фосфат, pH 7,0, 2°) вызывает быстрое удаление белка через мембрану (миллипоровые мембраны с диаметром пор 0,4 мк), но даже после 36 час содержание белка в комплексе не уменьшается. Тот же результат был получен при электродиализе чистого комплекса белка с гиалуроновой кислотой при 37 ма в течение 12 час — времени, которое необходимо для удаления 90% общего белка синовиальной жидкости. Сывороточные альбумин и углобулин легко проходят через мембрану. Огстон и Шерман так объяснили свои результаты Поскольку есть основания считать, что присутствующий в комплексе белок обладает нормальным размером молекул, и, следовательно, в свободном виде он должен легко проходить через миллипоровую мембрану (как проходят все остальные белки синовиальной жидкости быка и два исследованных белка сыворотки), полученные данные указывают, что этот белок нельзя выделить из комплекса простым электрофорезом . [c.32]

В работе [45] описан другой метод десорбции связавшегося материала с матрицы с использованием изоэлектрического фокусирования. Аффинный гель помещается в предварительно фокусированный градиент pH, который получают электрофорезом плоского слоя амфолитсодержащего геля. Система работает при низкой силе тока и высоком напряжении. Хотя ни этот метод, ни электрофоретическая десорбция по существу не были оптимизированы, оба метода открывают возможность проводить десорбцию в мягких условиях даже в случае систем с высоким сродством, таких, как биотин — авидин и антиген — антитело. [c.121]

Если примириться с некоторой диффузией полос во время окрашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих случаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаимодействия. В области нейтральных pH такие кислые красители, как СВВ, бромфеноловый синий и Fast green , заряжены отрицательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже pH 3,5. Щелочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд (р/>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях можно красить щелочными красителями, а щелочные — кислыми. Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтрализуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (pH 7) до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин, затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси метанол—вода (1 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные гели хранят в разбавленных водных растворах красителей во избежание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика азид натрия до концентрации 0,01% [Ru hel et al., 1978]. [c.95]

Как следует из изложенного, фракционирование нативных, двунитевых молекул ДНК по размерам с помощью электрофореза в гелях агарозы возможно, но до определенных значений их молекулярной массы. Фракционирование нативных высокополимерных РНК затруднено наличием двунитевых шпилек и неопределенностью их числа и размеров. Выше шла речь об электрофорезе денатурированных молекул ДНК в мягких условиях, в нейтральной области pH рабочих буферов. При этом однони- [c.128]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология