Электрофорез в гелях, разделение ферментов

Был предложен метод определения относительных активностей изоферментов пероксидаз, разделенных путем электрофореза в крахмальном геле [775]. 20 мл основного раствора бензидина (для его приготовления 2 г бензидина растворяют в 18 мл ледяной уксусной кислоты и к ним добавляют 72 мл воды) смешивали с 70,4 мг аскорбиновой кислоты, 20 мл 0,6%-ной Н2О2 н 60 мл воды. Аскорбиновая кислота восстанавливала окисленный бензидин, благодаря чему развитие синей окраски задерживалось до тех пор, пока аскорбиновая кислота не окислялась полностью в процессе инкубации. Время, требуемое для развития окраски, прямо пропорционально концентрации аскорбиновой кислоты и обратно пропорционально активности фермента. [c.289]

Электрофорез используется для выделения и разделения ферментов на конечных стадиях очистки, а также для препаративных и аналитических целей. Для препаративного выделения и очистки ферментов проводят зонный электрофорез па бумаге и в блоках или на колонках с различными наполнителями (целлюлозным порошком, крахмалом и другими), а также электрофорез в гелях — агар-агаровом, крахмальном, полиакриламидном. Электрофорез в гелях отличается от электрофореза на порошкообразных или пористых носителях. Здесь сочетаются два метода разделения ферментов — электрофоретический и метод, основанный на гель-фильтрации. Фракционирование ферментов на основе различной электрофоретической подвижности оказывается одним из самых эффективных методов. [c.201]

В ряде работ описано разделение ферментов [258, 307— 309] гемоглобина [257, 270, 310—314] и белков [270, 314—322] методом тонкослойного электрофореза на крахмальном геле. [c.165]

При электрофоретическом разделении ферментов можно применять множество различных систем буферных растворов и гелей. Однако в некоторых случаях следует позаботиться о том, чтобы предотвратить денатурацию белков в процессе электрофореза. Так, например, нельзя использовать буферы с чрезмерно высокими или низкими значениями pH, а при исследовании термолабильных ферментов необходимо тщательно охлаждать систему. В качестве носителей при разделении ферментов обычно применяют ацетат целлюлозы или гели. Бумага для этих целей непригодна, так как она сильно адсорбирует ферменты. [c.279]

Дальнейших успехов в химии гликонротеинов следовало ожидать на основе развития методов и лабораторной техники идентификации и количественного определения малых количеств сахаров и аминокислот, структурного анализа олиго- и полисахаридов, эффективного разделения и очистки белков, оценки гомогенности макромолекул и определения их молекулярных весов. С введением улучшенных методов исчерпывающего метилирования и периодатного окисления углеводов, реагентов (борогндридов щелочных металлов), избирательно восстанавливающих карбонильную группу, аналитической ультрацентрифуги Сведберга, аппарата Тизелиуса для электрофореза с подвижной границей, ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии, метода меченых атомов, метода фракционирования белков плазмы крови холодным спиртом по Кону, хроматографии на бумаге и на колонках, хроматографии на ионообменниках, полученных из целлюлозы, упрощенных микрометодов электрофореза (электрофорез на бумаге, крахмальном или агаровом гелях), иммуноэлектрофореза и, наконец, последнего по времени, но важного в этой области открытия конститутивных и индуцируемых бактериальных ферментов, действующих избирательно на гетеросахариды, настало время для третьего и наиболее сложного и плодотворного периода исследования гликонротеинов. [c.18]

Метод получения экстрактов клеток приведен в сжатой форме в табл. 4.2. Состав исходных буферов для электрофореза в крахмальном геле приведен в табл. 4.3. Компоненты для электрофоретического разделения и выявления в геле трех ферментов представлены в табл. 4.4. [c.121]

Гель-электрофорез использовали для изучения нуклеотидной последовательности ДНК генома до тех пор, пока не были открыты рестриктазы. К настоящему времени выделены сотни таких ферментов, каждый из которых узнает специфическую нуклеотидную последовательность длиной от 2 до 8 пар оснований и расщепляет двухцепочечную молекулу ДНК лишь в этом участке [108]. Точки расщепления обеих цепей ДНК могут находиться либо на одинаковом расстоянии от одного из концов молекулы (т. е. располагаться строго напротив друг друга), либо быть смещены относительно друг друга на несколько звеньев. В первом случае образуются фрагменты с тупыми концами, содержащие только спаренные нуклеотидные остатки, а во втором — с липкими , которые представляют собой небольшие участки одноцепочечной ДНК. Используя рестриктазы различной специфичности, можно расщепить высокомолекулярную ДНК на отдельные фрагменты, размеры большинства из которых находятся в диапазоне, приемлемом для разделения этих фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле [107]. Таким способом были получены уникальные фрагменты ДНК генома, которые затем были встроены в рекомбинантные ДНК-векторы [109]. Этот раздел посвящен разделению таких фрагментов. [c.184]

При обнаружении ферментов после электрофореза, как и в любой ферментативной реакции, важную роль играет pH среды. Этот фактор имеет особенно большое значение тогда, когда электрофорез проводят при значении pH, сильно отличающемся от оптимума pH для данной ферментативной реакции, а также при разделении белков путем изоэлектрофокусирования в неоднородной буферной системе с разными значениями pH. В этих случаях перед определением активности фермента гели инкубируют в охлажденном буфере с соответствующим значением pH. [c.281]

Восстановленные лигазами плазмиды вновь вводят в бактериальные клетки, и бактерии, содержащие эти плазмиды, в которых встроенная ДНК инактивирует геи селекции , отделяют от бактерий, содержащих нормальные плазмиды или вообще ие содержащих плазмид, выращивая их на средах с различными концентрациями антибиотика, В бактериях при репликации образуется много копий плазмид, и таким образом можно вырастить большие количества встроенных фрагментов ДНК, а затем снова просто выделить их путем расщепления тем же самым ферментом рестрикции с разделением полученных продуктов гель-электрофорезом. Использование этого метода рекомбинации ДНК произвело революцию в изучении геиов. [c.455]

Во многих методиках вспомогательные ферменты просто добавляют к инкубационной среде. Можно также использовать индикаторный гель , содержащий вспомогательный фермент (или ферменты). Еще один способ применения вспомогательного фермента описал Харрисон [518]. Для обнаружения после электрофореза в полиакриламидном геле гексокиназы, глюкозо- фосфатизомеразы и фосфоглюкомутазы к гелеобразующему раствору перед полимеризацией акриламида добавляют глюкозо-б-фосфат— дегидрогеназу. В результате вспомогательный фермент оказывается равномерно распределенным в геле и иммобилизованным благодаря возникновению ковалентных связей с матриксом. При этом он сохраняет способность катализировать превращение глюкозо-6-фосфата, образующегося под действием указанных выше ферментов. Таким образом, при инкубации геля в среде, содержащей NADP, ФМС и соль тетразолия, в местах локализации разделенных ферментов появляется формазан. [c.286]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

Сефадекс выполнял роль среды при разделении белков [125, 349—351]. Ферменты, которые нельзя разделить методом электрофореза на бумаге или тонких слоях крахмала без потери их активности, можно выделить без потери активности после электрофореза на сефадексе [349]. Иоханссон и Реймо [125] и Фазелла и сотр. [350] использовали сефадекс для двумерного тонкослойного разделения, в котором в одном направлении проводили тонкослойную гель-фильтрацию, а в другом — электрофорез. При приготовлении тонких слоев сефадекса сухой порошок смешивают с избытком подходящего буферного раствора (1 7,5) и оставляют на 24 ч. После этого удаляют избыток жидкости, полученный гель наносят на стеклянную пластинку и выравнивают слой стеклянным прутком, перемещая его по направляющим полоскам. Чтобы предотвратить потерю влаги в процессе электрофореза, слой геля можно покрыть стеклянной пластинкой. [c.169]

Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом исследова-ния. Они позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера (10 — 10 н. п.) в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований. С помощью метода электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Метод электрофореза основан на разделении (фрагментов) молекул ДНК, движущихся с различной скоростью в электрическом поле. В растворе ДНК существует в виде аниона, и при помещении раствора ДНК в электрическое поле молекулы будут двигаться к положительному полюсу (катоду). [c.27]

При проведении гель-фильтрации в препаративном масштабе, например при очистке ферментов и антител, часто приходится идти на компромисс, выбирая между высокой степенью разрешения и большой скоростью потока. Таким образом, хорошее разделение в какой-то мере приносится в жертву при использовании более крупных частиц геля, позволяющих быстрее пропускать через колонку нужный объем жидкости. Пористость частиц должна быть подобрана (часто эмпирически) так, чтобы можно было разделить как можно больше компонентов и чтобы на кривой элюирования нужный компонент располагался между Уо и Уо+У1. Для этого успешно применяется либо только одна гель-фильтрация, либо гель-фильтрация в сочетании с другими способами разделения. Молекулярную массу растворимых белков можно определять с помощью гель-фильтрации на сефа-дексах 0-75 и 0-100 [30, 50]. Для этого строят график линейной зависимости отношения Ух1Уо, где Ух — объем пика неизвестного компонент-э, а Ко — свободный объем, от логарифма молекулярной массы ряда ферментов и белков с известными молекулярными массами. Молекулярную массу неизвестного компонента находят по графику. Этот очень полезный метод в основном вытеснен сейчас другим, более быстрым и удобным методом диск-электрофореза в геле (разд. 16.5.1). [c.225]

Фриц и др. 408] обнаружили, что соотношение между изоферментами ЛДГ, выявленными с помощью электрофореза в геле и последующего специфического окрашивания разделенных зон, зависит от количества нанесенного на гель белка. Более того, соотношение изоферментов, определенное при электрофорезе, отличается от их соотношения при измерении другими методами. Меньшие количества фермента обнаруживали более высокую относительную активность, что, вероятно, объясняется медленным проникновением в гель субстрата и сопрягающего агента. При электрофорезе в микрогелях изоферментов глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы подобных отклонений не наблюдалось [257]. В этом случае субстраты, коферменты, сопрягающие агенты и другие низкомолекулярные соединения очень быстро проникают в гель, благодаря чему обеспечивается постоянный избыток субстрата и других реагентов. Таким образом, микрогель можно рассматривать как микрокювету и использовать его для количественного определения пикограммовых количеств ферментов, а также для изучения кинетики ферментативных реакций. Детальное описание этих методов дается в работе Нейхоффа [915]. [c.283]

Амилазную активность после электрофореза в полиакриламидном геле иногда выявляют с помощью метода индикатор ного геля. Гели помещают на пластину крахмала, приготовлен ную из 4%-ного гидролизованного крахмала в буферном раС творе, состоящем из 0,02 М борной кислоты и 0,01 М NaOH [668]. Затем гели инкубируют при 37 °С 15—30 мин (если для разделения панкреатических ферментов используют катионную систему) или 0,5—5 мин (в случае анионной системы). После инкубации крахмальную пластинку фиксируют и обрабатывают йодной кислотой и реактивом Шиффа. [c.297]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Антигены, Антигены, используемые для иммунизации, должны быть очень хорошо очищены, для чего можно использовать метод иммуноаффинной хроматографии или классические методы . Чистая GGT из почек быка может быть выделена солюбилизацией фермента в присутствии дезоксихолата натрия с последующей обработкой -бутанолом, фракционированием сульфатом аммония и хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [27]. Полученный после разделения на сефарозе 6В препарат GGT подвергается протеолитическому гидролизу бромелаином, и полученная GGT (легкая форма) очищается электрофорезом в полиакриламидном геле [28]. Чистая GGT из почек крысы (фермент П1) может быть получена [29] подобным методом. [c.153]

Рис. 4. Пептидные карты по Кливленду. Иодированные поверхностные иммуноглобулины клеток селезенки выделяли иа иммуиосорбенте с последующим фракционированием в ДСН-ПАГЭ. Участки геля, содержащие мю- и дельта-цепи 12, вырезали и повторно подвергали электрофорезу, как описано в тексте, без ферментов или с различным количеством протеаз. Разделение проводили в ДСН-ПАГЭ (Л — 8%-ный гель, Б—18%-иый гель). Молекулярная масса различных белковых маркеров указана по краю фотографии. Свер-

Для изучения четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика использовали препараты фермента, очищенные в 150—300 раз. Тремя независимыми методами электрофорезом в однородном геле и в градиенте концентрации полиакриламидного геля, путем разделения в тонком слое сефадекса С-200, с помощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом С-200 — была обнаружена большая гетерогенность препарата в отношении НАД-киназы [2, 4]. Локализацию фермента в геле определяли по измерению активности в элюатах, полученных после разрезания столбика геля на диски толщиной 2 мм. При это оказалось, что по данным диск-электрофореза в однородном геле ферментативной активностью обладают четыре зоны, характеризующиеся значениями Rf 0,1, 0,52, 0,73 и 0,98. Повторный электрофорез белка с электрофоретической подвижностью, близкой к 1,0, после его элюции и кондентрирования обнаружил несколько белков с более низким, чем у исходного, значением Rf (0,73, 0,52, 0,07). [c.137]

Двумерный гель-электрофорез широко используется как аналитический метод. Он заключается в том, что полоску геля, содержащую белки, разделенные, например, с помощью изоэлектрического фокусирования, накладывают на кромку пластины другого геля, содержащего ДСН. Электрофорез проводится в направлении, перпендикулярном длинной оси полоски первого геля (рис. 9.5). Окончательные результаты разделения зависят от того, что в первом направлении белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками, а во втором — в соответствии с размерами субъединиц. Неочищенные клеточные экстракты в двумерных системах могут давать до 1000 индивидуально детектируемых белковых компонентов. Однако для анализа очищенного фермента необходимо проводить лишь одномерный электрофорез в каждой из двух систем (изоэлектри- [c.324]

Применение в качестве носителей гелей значительно расширило возможности этого метода и сферу его применения. Большим преимуществом метода является возможность варьирования степени иористости геля, что позволяет улучшать разделение молекул, обладающих близкими зарядами, но различающихся по размерам и (или) форме. Вследствие этого гель-электрофорез чрезвычайно удобен для разделения смесей нуклеиновых кислот (особенно молекул РНК) и белков (включая ферменты, изоферменты и структурные белки). Степень пористости крахмальных и агаровых гелей не удается контролировать до такой степени, как полиакриламидных, но они также оказались весьма полезными при разделении смесей различных высокомолекулярных соединений. [c.137]

Задачи, стоящие перед исследователями, требовали определения нуклеотидных последовательностей довольно протяженных фрагментов ДНК, которые не могли быть прочитаны за одно электрофоретическое разделение продуктов секвенирующих реакций. В первые годы секвенирования ДНК предел чтения с радиоавтографа геля редко превышал 250-300 нуклеотидов для одной матрицы. Да и фермент ДНК-полимераза I, ее Кленовский фрагмент, имея низкую процессивность, не мог эффективно строить комплементарную цепь ДНК большой протяженности. Метод химической деградации вкупе со стандартным гель-электрофорезом того времени также не позволял читать более 250-300 нуклеотидов. В связи с этим решение проблемы секвенирования больших вставок, нуклеотидные последовательности которых не могли быть определены в одном эксперименте, заключалось в выработке специальных подходов. С течением времени, благодаря различным новшествам, разрешающая способность методов секвенирования заметно возросла и за счет этого увеличился оптимальный размер вставок до 500 и 1000 пн, позволяющий определить их последовательность в процессе одного электрофоретического разделения. Резко возросли и задачи, предполагающие уже определение нуклеотидных последовательностей еще более крупных фрагментов ДНК или даже целых геномов. Все это привело к разработке большого числа различных стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК, к рассмотрению которых мы и приступаем. [c.234]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Первые исследования белков проводились со сложными белковыми смесями, такими, как яичный белок, сыворотка крови, экстракты из растительных и живот ных тканей, а подчас и цельные ткани. Лишь в конце XIX в. получили распространение методы разделения белков с помош ью осаждения нейтральными солями. В 30-е годы XX в. были получены первые белки в кристаллическом состоянии. Получение веш ества в кристаллическом виде служит одним из надежных доказательств чистоты (гомогенности) препарата. В частности, в 1926 г. Д. Самнер выделил из семян канавалии белок (фермент) уреазу в кристаллическом состоянии Д. Нортроп и М. Кунитц в 1930-1931 гг. получили кристаллы пепсина и трипсина. После этих пионерских работ выделение индивидуальных белков стало частым событием в истории биохимии, особенно после 50-х годов, когда начали применять современные методы фракционирования — хроматографию на гидрофильных ионообменниках, гель-фильтрацию ( молекулярное просеивание ), новые методы электрофореза и др. [c.17]

Смотреть страницы где упоминается термин Электрофорез в гелях, разделение ферментов: [c.270] [c.174] [c.282] [c.81] [c.269] [c.258] [c.174] [c.281] [c.348] [c.88] [c.92] [c.93] [c.106] [c.168] [c.213] [c.250] [c.277] [c.294] [c.81] [c.158] [c.218]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология