Поиск продуцентов рестриктаз

Логичным следствием, вытекающим из вышеизложенных обобщений, явился бы выбор в качестве объекта исследования в опытах по поиску продуцентов рестриктаз штаммов технологичных видов микроорганизмов. Однако, с практической точки зрения результативность таких экспериментов оценивается не только в отношении количества выявляемых продуцентов, но и качественного состава субстратных специфичностей [c.24]

С задачей определения активности рестриктаз приходится сталкиваться в самых различных экспериментах в опытах по поиску продуцентов, изучению влияния условий культивирования на содержание целевых ферментов в биомассе, их очистке и характеристике каталитических свойств. Специфической чертой области энзимологии, посвященной изучению рестриктаз, является тот факт, что в подавляющем большинстве вышеуказанных опытов проводится в основном только качественная оценка активности исследуемых ферментов. Если в случае поиска продуцентов рестриктаз это является оправданным, то в ходе их очистки вынужденным. Последнее обстоятельство объясняется отсутствием простых количественных методов определения активности специфических эндонуклеаз. [c.126]

ПОИСК ПРОДУЦЕНТОВ РЕСТРИКТАЗ [c.130]

Биологические подходы к поиску продуцентов рестриктаз [c.131]

Исключительное значение специфических эндонуклеаз обусловлено в первую очередь той ролью которую эти ферменты сыграли и продолжают играть в молекулярно-генетических исследованиях вообще и генетической инженерии в частности. Дальнейшее развитие этих ведущих направлений современной биологической науки и их прикладных приложений, имеющих самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем, во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности. Все это стимулировало интенсивный поиск продуцентов новых специфических эндонуклеаз и организацию их промышленного выпуска. [c.4]

Резюмируя рассмотрение методических аспектов поиска специфических эндонуклеаз хотелось бы обратить внимание на еще некоторые принципиальные возможности и недостатки биологического и биохимического подходов. Использование обоих методов не дает полной гарантии, что во всех случаях при наличии в исследуемой культуре целевого фермента он будет выявлен. Очевидно, что этими методами могут тестироваться только те специфические эндонуклеазы, для которых в используемых субстратах имеются узнаваемые ими последовательности нуклеотидов. В случае биологического метода набор субстратов ограничен фагами, способными размножаться и дать лизис на исследуемом штамме. Это ограничение значительно сужает возможности вариации субстратов, тем более, что, как указывалось, наблюдается тенденция отбора фагов с уменьшенным числом сайтов, узнаваемых ферментами СХС их хозяев [141]. В случае же применения биохимических методов теоретически не существует препятствий для использования различных по первичной структуре субстратов и, тем самым, при достаточно большом их наборе можно надеяться значительно уменьшить вероятность отрицательного результата в опытах по по-иску продуцентов рестриктаз, обусловленного обсуждаемой причиной. [c.140]

Самым прямым путем решения обсуждаемого вопроса является систематическое изучение штаммов отдельно взятых видов микроорганизмов как в отношении частоты встречаемости продуцентов рестриктаз, так и спектра субстратных специфичностей обнаруженных ферментов. Рассмотрение данных, представленных в табл. 4, убеждает, что систематическое исследование даже первого вопроса является малохарактерным для опытов по поиску продуцентов рестриктаз. Представляется, что именно такие исследования призваны пролить свет на качественные закономерности распространения рестриктаз (в том числе и на вопрос о таксоноспецифичности рестриктаз), имеющие непосредственное отношение к вопросу о прогнозировании результативности экспериментов по поиску рестриктаз в случае реализации обсуждаемого подхода. [c.25]

Как уже отмечалось (и это имеет принципиальное значение), электрофоретический метод позволяет в одном опыте, путем рассматривания гелей, дифференцировать специфическую и неспецифическую нуклеазные активности и наличие нескольких рестриктаз. Конечно, рассмотренные выше количественные методы после соответствующих их модификаций можно адаптировать и для решения таких задач. Однако, это еще более усложнило бы их применение. Поэтому в опытах по поиску продуцентов рестриктаз и в значительной мере в экспериментах по их очистке электрофоретический метод не имеет себе равных. [c.130]

Первым этапом по поиску продуцентов специфических эндонуклеаз является получение бесклеточных экстрактов исследуемых культур. Для разрушения клеток в таких опытах обычно используется их обработка ультразвуком [104, 246, 261]. Иногда ультразвуковой дезинтеграции предшествует обработка клеток лизоцимом [245] или лизостафином [258]. В литературе имеются сведения и о некоторых реже используемых для разрушения клеток в обсуждаемых экспериментах, приемах. Так, Смит с соавт. [251] продемонстрировали, что рестриктазы, локализованные в периплазматическом пространстве клеток, могут быть переведены в раствор в результате осмотического шока, и успешно использовали этот прием в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. Механическое разрушение клеток при помощи гомогенизатора Поттера было предложено Майером и Райхенбахом [179]. Эти исследователи сравнивали три различных метода разрушения клеток ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический. Оказалось, что наиболее эффективным приемом в отношении выхода рестриктаз является обработка клеток ультразвуком. Осмотический шок и применение гомогенизатора Поттера дали выход соответственно на 40—60% и 20—40% ниже. Оказалось, что осмотический шок высвобождает рестриктазы только из грамотрицательных бактерий. По мнению авторов, механическое разрушение дает вполне приемлемые для опытов по поиску продуцентов рестриктаз результаты. Этот способ является менее трудоемким по сравнению с другими апробированными методами. Он успешно [c.136]

Хотя экспресс-методы скрининга штаммов микроорганизмов на наличие рестриктаз по вышеизложенным причинам не являются универсальными (как и все остальные методы) их максимальная простота позволяет предположить о возможностях широкого их применения в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. На основе цитированных работ создается впечатление, что они пригодны для проверки широкого круга таксонов. Случаи отсутствия пермеализации могут быть идентифицированы визуально (например, по отсутствию в экстрактах клеточ- [c.139]

Уже первые опыты по поиску продуцентов специфических эндонуклеаз, последовавшие за открытием первой рестриктазы II типа — Hind II в Н. influenzae Rd [354], продемонстрировали как их широкое распространение в этом роде микроорганиз- [c.13]

Для обобщений, касающихся вопроса о частоте встречаемости продуцентов рестриктаз в различных таксонах, необходимы сведения о доле штаммов, давших положительный результат, среди проверенных. Однако, обращение к литературным источникам убеждает в относительной скудности таких сведений. В первую очередь значительная часть данных, представленных в списке рестриктаз Робертса [319], основана на неопубликованных результатах, полученных многими авторами, что исключает возможность обратиться к первоисточникам для поиска необходимой информации. Среди опубликованных работ, лишь в относительно незначительной их части приводятся указания о числе проверенных штаммов и количестве выявленных продуцентов. Эти сведения суммированы в табл. 4 в которой приводятся только результаты экспериментов, где одновременной проверке подвергалось не менее 5-ти штаммов одного таксона. Такая группа для обобщений, касающихся частоты встречаемости продуцентов рестриктаз, конечно, является очень маленькой, но скудность документированных данных о систематическом их поиске вынуждает рассматривать и такие нерепрезентативные с количественной точки зрения выборки. Однако, имеется один показатель распространения рестриктаз, который как раз хорошо иллюстрируется данными, полученными при исследовании именно малочисленных групп микроорганизмов, относящихся к различным таксонам. Имеется в виду их повсеместное распространение. Среди 21-го перечисленного в табл. 4 рода, только в случае La toba illus ни в одном из проверенных 6-ти штаммов не удалось обнаружить рестриктазную активность. В остальных случаях, большинство которых тоже представлены немногочисленными выборками было обнаружено хотя бы по одному продуценту специфических эндонуклеаз. Вполне вероятно, что они имеются и в штаммах La toba illus, но для их выявления необходимо было проверить большее число щтаммов. Это предположение недавно было подтверждено экспериментально [319]. [c.21]

Использование в качестве продуцентов в препаративной биохимии рестриктаз ограниченного круга видов микроорганизмов позволило бы во многом унифицировать этапы их получения. Выгоды от реализации такого подхода очевидны. Однако, его результативность во многом зависит от удачного выбора объекта исследования в опытах по поиску продуцентов. Он должен решаться на основе технологических соображений и учитывать целый комплекс показателей особенности культивирования продуцента, его патогенность, фоновое содержание нежелательных примесей в бесклеточных экстрактах и т. д. [c.33]

Исключительная значимость рестриктаз как аналитических реагентов на долгое время определило развитие исследований в этой области в основном в сторону решения прикладных задач, которые реализовывались путем поиска новых продуцентов, очистки и характеристики субстратной специфичности открытых ферментов. В ходе этих экспериментов, вне зависимости от поставленных целей, были накоплены данные касающиеся вопросов распространения рестриктаз и вариабильности характеристик проявления их специфичности. Со временем все больше внимания стало уделяться углубленному и целенаправленному изучению вышеупомянутых, а также некоторых других вопросов, имеющих фундаментальное общепознавательное значение. Среди последних можно упомянуть исследование структуры генов кодирующих рестриктазы, физико-химических и энзиматических характеристик рестриктаз, изучение молекулярных механизмов белок-нуклеинового узнавания. Указанные направления исследований далеки от завершения и находятся на разных стадиях развития. Можно прогнозировать, что они, а также [c.4]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология