Получение бесклеточных экстрактов

Над проблемой спиртового брожения успешно работал А. Н. Лебедев. Им был разработан (1911) более простой метод получения бесклеточного экстракта из дрожжей, содержащего активный комплекс ферментов, объединяемых одним названием — зимаза. Ферменты переходят в раствор после непродолжительного автолиза дрожжей — мацерации, почему этот препарат и получил название мацерационного сока Лебедева. С этим препаратом А. Н. Лебедев провел большую работу по изучению химизма спиртового брожения. [c.245]

Функционирование системы из зародышей пшеницы и ее состав существенно не отличаются от таковых ретикулоцитарной системы биосинтеза белка. Различия заключаются, главным образом, в методах получения бесклеточных экстрактов. Зародыши обычно выделяют из сухих зерен озимой пшеницы. Преимуществами этих бесклеточных белоксинтезирующих систем перед другими являются возможность длительного хранения и доступность исходного биологического материала (зерен сортовой пшеницы), что обеспечивает воспроизводимость получаемых результатов и не требует проведения экспериментов с лабораторными животными. [c.190]

С учетом вышеуказанного в качестве основных этапов выделения рестриктаз будут рассмотрены следующие получение бесклеточных экстрактов, разделение нуклеиновых кислот и целевых ферментов и хроматографическая очистка последних. [c.143]

Получение бесклеточных экстрактов [c.144]

Следующим этапом получения бесклеточных экстрактов является центрифугирование клеточных гомогенатов. Обычно с этой целью используется высокоскоростное центрифугирование (10 000—50 000 xg 15—60 мин) [10, 100, 123, 125, 188, 296], обеспечивающее удаление клеточных обломков или ультрацентрифугирование, при 100 000 xg в течение 1—2 часов [78, 101, 149, 156, 179, 202, 218, 219, 235, 241 и др.], позволяющее наряду с удалением клеточных обломков перевести в осадок и рибосомы [198]. В доступной литературе имеется несколько примеров ультрацентрифугирования бесклеточных экстрактов при 250 000 xg 17 часов, примененного в случае выделения рестриктаз N i I и Nde I [292, 293]. Очевидно, что в последнем случае достигается большая очистка целевых ферментов по сравнению с центрифугированием гомогената разрушенных клеток в других вышеуказанных режимах. Ультрацентрифугирование в режиме, обеспечивающем удаление рибосом, применяется довольно часто, что находит объяснение в достижении некоторой очистки целевых ферментов. [c.144]

Пероксидаза жирных кислот обнаружена в бесклеточных экстрактах, полученных из семядолей арахиса и сафлора. Были активны также экстракты ацетонового порошка прорастающего гороха. Никакая активность не выявлялась в люпине, сое, подсолнечнике, клещевине и в тканях животных. Когда дифференциальному центрифугированию подвергли бесклеточные экстракты семядолей арахиса, пероксидаза жирных кислот была найдена в митохондриальной и микросомной фракциях, а также в надосадочной жидкости. Фермент был выделен в частично очищенном виде при обработке экстракта ацетонового порошка семядолей арахиса сернокислым аммонием (СА-фермент). [c.310]

Большим преимуществом бесклеточных систем перед целыми клетками является доступность их отдельных компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, pH, ингибиторы и активаторы и т.п.). Кроме того, в бесклеточной системе можно легко заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с помощью бесклеточных систем, невозможно было бы иметь при использовании живых клеток, так как последние при нарушении гомеостаза нередко гибнут. При этом бывает трудно определить, какой же компонент оказался критическим. К сожалению, перечисленные достоинства бесклеточных систем одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения клеток безвозвратно исчезают те многочисленные взаимодействия между их компонентами, благодаря которым можно без труда отличить живую клетку от бесклеточного экстракта. [c.185]

В 1930 г. вышла книга Холдейна о ферментах [I], прочесть которую стоит и сегодня. Более всего в этой книге меня поразило несоответствие между обширностью для того времени знаний о свойствах и действии ферментов и их ограниченностью в отношении химической природы ферментов вопрос о том, являются ли ферменты белками, все еще широко дискутировался. Такая односторонность была обусловлена отсутствием методов, позволяющих проводить прямое исследование ферментов. Вся информация носила косвенный характер — ее источником служили опыты по действию ферментов на соответствующие субстраты. Тем не менее уже спустя немногим более 30 лет после получения Бухнером в 1897 г. бесклеточного экстракта ферментов были заложены основы современной ферментативной стационарной кинетики. [c.11]

Выделение оксистероид-дегидрогеназ осущест-вляется обычными в химии ферментов методами. После разрушения клеток ультразвуком или растиранием с AlgOg полученные бесклеточные экстракты центрифугируются и ферменты, содержащиеся в надосадочной жидкости, выделяются комбинированием различных методов — хроматографии на ионообменниках, гелевой фильтрации, фракционированного осаждения сульфатом аммония и т. д. Удельная активность экстрактов увеличивается при этом в десятки и сотни раз. [c.119]

Первым этапом по поиску продуцентов специфических эндонуклеаз является получение бесклеточных экстрактов исследуемых культур. Для разрушения клеток в таких опытах обычно используется их обработка ультразвуком [104, 246, 261]. Иногда ультразвуковой дезинтеграции предшествует обработка клеток лизоцимом [245] или лизостафином [258]. В литературе имеются сведения и о некоторых реже используемых для разрушения клеток в обсуждаемых экспериментах, приемах. Так, Смит с соавт. [251] продемонстрировали, что рестриктазы, локализованные в периплазматическом пространстве клеток, могут быть переведены в раствор в результате осмотического шока, и успешно использовали этот прием в опытах по поиску продуцентов рестриктаз. Механическое разрушение клеток при помощи гомогенизатора Поттера было предложено Майером и Райхенбахом [179]. Эти исследователи сравнивали три различных метода разрушения клеток ультразвуковую дезинтеграцию, осмотический шок и механический. Оказалось, что наиболее эффективным приемом в отношении выхода рестриктаз является обработка клеток ультразвуком. Осмотический шок и применение гомогенизатора Поттера дали выход соответственно на 40—60% и 20—40% ниже. Оказалось, что осмотический шок высвобождает рестриктазы только из грамотрицательных бактерий. По мнению авторов, механическое разрушение дает вполне приемлемые для опытов по поиску продуцентов рестриктаз результаты. Этот способ является менее трудоемким по сравнению с другими апробированными методами. Он успешно [c.136]

В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди Очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие отсутствие сайтов узнавания может иммитироваться природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241],. из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей,, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка- [c.140]

Основными этапами выделения любой рестриктазы является получение бесклеточных экстрактов и собственно очистка целевых ферментов, осуществимая с применением традиционных приемов препаративной биохимии белковых соединений (высаливание, хроматографическое фракционирование и т. д.). Вместе с тем следует отметить, что процессам выделения рестриктаз, как и других ферментов нуклеинового обмена, характерен ряд специфических особенностей. В первую очередь это замечание относится к тому вниманию, которое уделяется разделению целевых ферментов и нуклеиновых кислот, в принципе способных влиять на перераспределение как рестриктаз, так и нуклеаз между фракциями, получаемыми в результате применения различных методов выделения целевых ферментов. Поэтому этот этап является одним из ключевых в схемах выделения рестриктаз, от результатов проведения которого во многом зависит успех дальнейшей их очистки. [c.143]

И, наконец, можно отметить, что бесклеточные экстракты, полученные из Torulopsis, способны превращать олеиновую кислоту в L-17-оксиолеиновую [120]. [c.58]

Штумнф [24] исследовал распад глицерина до СОг в бесклеточных экстрактах, полученных из семядолей прорастающего арахиса. В присутствии митохондрий, растворимой цитоплазматической фракции и ряда кофакторов 1,3-С1 -глицерип окислялся до С Юд. Необходимыми кофакторами служили АТФ, а-кетоглутаровая кис- [c.294]

Схема, приведенная на фиг. 82, разработана Штумпфом и его сотрудниками на основании данных, полученных с бесклеточными экстрактами семядолей арахиса. [c.310]

Актиномицет Streptomy es hydrogenans продуцирует 20р-оксистероид-дегидрогеназу, катализирующую взаимные превращения 20-кето- и 20р-оксистероидов. Этот фермент был получен в кристаллическом состоянии с выходом около 12% от содержания его в исходном бесклеточном экстракте молекулярный вес фермента, определенный седиментационным методом, имеет величину порядка 118 000 [5,140—144]. В последнее время удалось получить также частично очищенные препараты 20р-оксистероид- [c.119]

Опыты с бесклеточными экстрактами С. fal ata подтвердили данные, полученные с цельной культурой. При этом удалось выделить два фермента, один из которых восстанавливает (-(-)-эиантиомер, а другой —. (—)-энантиомер. Оба фермента, аналогично оксистероид-дегидрогеназам, [c.128]

Систему для белкового синтеза можно получить в виде бесклеточного экстракта (см. гл. 6). Исходная процедура состояла в следующем клетки бактерии Е. соИ разрушали, из полученного экстракта методом центрифугирования удаляли фрагменты оболочек и мембран. ДНК разрушали добавлением ДНКазы (а бактериальная мРНК слишком нестабильна и не могла служить эндогенной матрицей). Полученная в результате надосадочная фракция активно транслирует любую добавленную мРНК, поскольку в этой фракции содержатся необходимые предшественники и источник энергии. Позднее были разработаны другие системы, содержащие более чистые компоненты. Такие системы были созданы из многих типов как прокариотических, так и эукариотических клеток. [c.59]

Мыши AKR исходно были выведены как инбредная линия с высокой частотой спонтанных лейкемий. Тимомы, возникающие у мышей AKR, обусловлены вертикальной (генетической) передачей эндогенного опухолеродного вируса. Как показал Гросс (1951), тимомы могут также передаваться горизонтально путем инокуляции бесклеточного экстракта, полученного из опухолей мышей AKR новорожденным мышам СЗН, у которых частота спонтанных лейкемий исключительно низка. Приблизительно у [c.382]

Точность этого метода определяется тем, насколько полно выявляется активность исследуемого фермента во фракции хлоропластов и в надосадочной жидкости. Некоторые ферменты типа РуБФ-карбокс-илазы при попадании в бесклеточный экстракт становятся лабильными или ингибируются. Поэтому очень важно, чтобы активность фермента в суммарном бесклеточиом экстракте (полученном без применения осмотически активных веществ) была равна сумме активностей этого фермента во фракции хлоропластов и в надосадочной жидкости. [c.560]

Методы, используемые для проверки исследуемых культур (см. разд. 2, часть II), не дают полной гарантии выявления специфических эндонуклеаз во всех штаммах, содержащих их. Одной из очевидных причин этому явлению в случае применения биохимического метода может быть маскирование рестриктазной активности неспецифическими нуклеазами. Именно неблагоприятное соотношение этих ферментов по мнению Майера и Райхенбаха [249 ] послужило причиной того, что среди 45 проверенных штаммов ytophaga только в двух случаях удалось выявить специфическое фрагментирование субстратов, проинкубированных с бесклеточными экстрактами исследуемых культур. Таким образом, применение традиционного метода тестирования наличия рестриктаз в исследуемых культурах дало в обсуждаемом случае исключительно низкую частоту встречаемости продуцентов. Для того, чтобы выяснить, насколько полученные данные отражают истину, необходимо применить другие методические подходы. [c.24]

Использование в качестве продуцентов в препаративной биохимии рестриктаз ограниченного круга видов микроорганизмов позволило бы во многом унифицировать этапы их получения. Выгоды от реализации такого подхода очевидны. Однако, его результативность во многом зависит от удачного выбора объекта исследования в опытах по поиску продуцентов. Он должен решаться на основе технологических соображений и учитывать целый комплекс показателей особенности культивирования продуцента, его патогенность, фоновое содержание нежелательных примесей в бесклеточных экстрактах и т. д. [c.33]

Наряду с вышеуказанными, относительно простыми методами первичной обработки бесклеточных экстрактов, имеются примеры использования с этой целью и более сложных приемов. Так, в экспериментах по поиску рестриктаз в штаммах рода Proteus, грубые экстракты пропускали через биогель А 0,5 м и тестировали активность целевых ферментов в собираемых фракциях [104]. В аналогичных экспериментах, заключавшихся в проверке 147 штаммов бактерий, их бесклеточные экстракты пропускали через фосфоцеллюлозу [261] и тестировали рестриктазную активность в фракции, содержащие несор-бировавшие белки и элюате, полученном при помощи ступенчатой элюции связанных сробентом белков 1 М раствором КС1. Трудоемкость последних двух приемов является очевидной. [c.137]

Во многие схемы очистки рестриктаз вводится стадия высаливания белков сернокислым аммонием. С применением этой процедуры решаются многие задачи очистка, концентрирование разбавленных растворов, отделение рестриктаз от СС и ПЭИ. Так Муррей с соавт, [188] подобрали условия эксперимента, позволяющие разделить на этой стадии рестриктазы Ava I и Ava П, выделяемые из одной биомассы, которые переходили в осадок при 20—40% и 50—70% насыщении бесклеточного экстракта А. variabilis сернокислым аммонием соответственно. Примером другого варианта фракционирования высаливанием является работа Модрича и Забелы [184], где была использована экстракция белкового осадка, полученного при 70% насыщении грубого экстракта Е. соИ RY13 солью, растворами со ступенчато понижающейся концентрацией сернокислого аммония. В результате проведения такой процедуры удалось повысить удельную активность целевого фермента в 2,7 раза. Фракционное высаливание белков нашло применение в схемах очистки многих рестриктаз [74, 98, 115, 118, 140, 142, 152, 173, 235, 247, 248, 296 и др.]. [c.154]

Гепаринсефароза (ГС), по мнению авторов, имеет ряд положительных характеристик. Сорбент стабилен, легко регенерируется, может быть использован многократно, обладает хорошими проточными свойствами и высокой емкостью, что позволяет использовать колонки небольшого объема. К положительным свойствам ГС следует отнести и то, что согласно наблюдениям указанных исследователей, часть не специфических эндонуклеаз из бесклеточных экстрактов, полученных после удаления нуклеиновых кислот, или не связывалась с гепаринсефарозой, или элюировались преимущественно при более низкой ионной силе чем рестриктазы. [c.156]

В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов. [c.163]

В 1932 г. группа исследователей, возглавляемая Г. Шпеманном, экспериментально демонстрирует, что (1) инактивированные нагреванием ткани организатора" сохраняют свои индуцирующие свойства при их имплантации в вентральную эктодерму (2) культуральная среда из-под изолированного организатора обладает индуцирующей активностью. Стало ясно, что индуцирующие сигналы организатора должны иметь химическую природу. С этого момента предпринимаются неоднократные попытки идентифицировать индуцирующие молекулы, определить их свойства и механизмы действия. Эта трудоемкая, подчас героическая работа по биохимическому фракционированию бесклеточных экстрактов из эмбриональных тканей осложнялась также несовершенной и трудоемкой системой биотестирования полученных фракций. В соответствии с исходными данными Шпеманна и Мангольд (1924) в качестве эмбриональной тест-ткани использовали вентральную эктодерму ранней гаструлы амфибий. Эта эктодерма еще до гаструлы коммитиро- [c.67]

Смотреть страницы где упоминается термин Получение бесклеточных экстрактов: [c.91] [c.124] [c.477] [c.154] [c.33] [c.40] [c.71] [c.415] [c.482] [c.442] [c.281] [c.57] [c.154] [c.210] [c.58] [c.363] [c.346] [c.137] [c.138] [c.152] [c.210] [c.151] [c.167]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология