Характеристика субстратной специфичности рестриктаз

Ферментам рестрикции в клетке всегда сопутствуют идентичные по субстратной специфичности модифицирующие метилазы, защищающие внутриклеточную ДНК от действия сопряженной рестриктазы. Учитывая близкую функциональную взаимосвязанность ферментов рестрикции-модификации следовало бы их рассматривать совместно. Однако, метилтрансферазы этого типа подробно рассмотрены в обзоре, опубликованном в 23 томе серии Молекулярная биология. Итоги науки и техники . [9]. В настоящей работе сведения об модифицирующих метила-зах, являющихся компонентами систем рестрикции-модификации, будут представлены только в той мере, в которой это будет необходимо для характеристики рестриктаз. [c.5]

Исключительная значимость рестриктаз как аналитических реагентов на долгое время определило развитие исследований в этой области в основном в сторону решения прикладных задач, которые реализовывались путем поиска новых продуцентов, очистки и характеристики субстратной специфичности открытых ферментов. В ходе этих экспериментов, вне зависимости от поставленных целей, были накоплены данные касающиеся вопросов распространения рестриктаз и вариабильности характеристик проявления их специфичности. Со временем все больше внимания стало уделяться углубленному и целенаправленному изучению вышеупомянутых, а также некоторых других вопросов, имеющих фундаментальное общепознавательное значение. Среди последних можно упомянуть исследование структуры генов кодирующих рестриктазы, физико-химических и энзиматических характеристик рестриктаз, изучение молекулярных механизмов белок-нуклеинового узнавания. Указанные направления исследований далеки от завершения и находятся на разных стадиях развития. Можно прогнозировать, что они, а также [c.4]

Использование рационального редизайна полипептидных цепей рестриктаз E oRl и E oRV с целью изменения их субстратной специфичности пока не завершилось успехом [320]. Замены аминокислотных остатков, вовлеченных в процесс распознавания субстрата, неизменно сопровождались снижением специфичности фермента и уменьшением его удельной активности. Предполагается, что сложная сеть ДНК-белковых взаимодействий при взаимодействии рестриктазы с ДНК формируется кооперативно, и любые вмешательства в эту сеть приводят к отрицательным последствиям. В настоящее время остаются в значительной степени непонятными энергетические характеристики динамических структур, формирующихся в комплексах фермент-ДНК, а также, что еще более важно, нет возможности количественной оценки влияния каждого контакта в таких комплексах на все другие контакты, то есть на кооперативность взаимодействий. Кроме того, на сегодняшний день отсутствует понимание структурных и термодинамических особенностей, а также функциональной роли альтернативных конформаций ферментов, которые он принимает в комплексах с частично измененными сайтами рестрикции и которые не может расщеплять. Однако без таких знаний трудно рационально воздействовать на специфичность действия рестриктазы. [c.443]

В работах, посвященных изучению наиболее многочисленной группы эндонуклеаз, которые по своей субстратной специфичности могли бы быть отнесены к рестриктазам II типа, в основном их характеристика ограничивается определением узнаваемого участка, места расщепления субстрата и определением потребности в ионах магния. По мере накопления информации о типах построения узнаваемых участков выявилась определенная гетерогенность этой группы ферментов. Так рестриктазы, узнающие ассимметрическую последовательность нуклеотидов и расщепляющие ДНК в стороне от нее, обозначены IIS [364]. Закономерно вставал вопрос о том, что еще большая гетерогенность могла бы быть обнаружена при изучении других дифференцирующих признаков, например, структурной организации и реакции на другие кроме ионов магния кофакторы (АТФ, Адо-мет). [c.8]

Значительная часть исследований, в особенности на первом этапе изучения рестриктаз, была посвящена поиску, очистке и характеристике специфичности рестриктаз. Это направление исследований не потеряло своей актуальности и в настоящее время и стимулируется как желанием обнаружить новые по специфичности ферменты с целью их дальнейшего применения в качестве аналитических реагентов, так и необходимостью изучения таких фундаментальных вопросов как закономерность распространения рестриктаз и вариабильность их субстратной специфичности. В настоящем разделе будут рассмотрены некоторые методические аспекты решения обсуждаемых, а также ряда других задач (определение активности, клонирование генов рестрикции-модификации). [c.126]

Требования к уровню функциональной чистоты препаратов рестриктаз, используемых в опытах по определению их субстратной специфичности, далеко не одинаковы и диктуются заданной глубиной исследования этой характеристики. В случае применения рестриктаз в качестве аналитических реагентов качество препаратов, в зависимости от сферы применения, тоже может варьировать. В опытах по физическому картированию допустимо использование ферментов, содержащих в качестве примесей нелимитированное количество фосфатаз. Уровень присутствия неспецифических нуклеад ограничивается та- [c.141]

Стремительный рост числа новых рестриктаз и определение основных типов их субстратной специфичности [183] привел к появлению самого простого из косвенных методов, так называемого метода визуального сравнения, сущность которого заключается в сопоставлении результатов расщепления одного и того же субстрата известной и исследуемой рестриктазами. Так как при действии какой-либо рестриктазы на индивидуальную ДНК образуется характерный набор рестриктов, то в случае совпадения картин их электрофоретического разделения (ре-стриктограмм), делается вывод об идентичной специфичности этих ферментов. Иногда применение этого метода сводится к сравнению полученной рестриктограммы с таковыми, представленными в каталожных изданиях [189]. Очевидно, что настоящий метод пригоден только для характеристики аналогов уже известных рестриктаз (изошизомеров). Следует однако отметить, что такая оговорка недействительна в случае впервые обнаруженных рестриктаз с палиндромной сайтовой специфичностью, так как все варианты предполагаемого электрофоретического распределения фрагментов в этом случае рассчитаны на ЭВМ и в графическом виде представлены в справочной литературе [190]. [c.171]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология