Характеристика ферментов, используемых в ИФА

Метод моделирования и получения искусственных мембран основан на получении и исследовании моно- и бимолекулярных липидных слоев, везикул, липосом и протеолипосом. Сущ ествует два основных типа искусственных мембран классические плоские и сферические мембраны различного размера. Для получения искусственных мембран используют различные фосфатиды, нейтральные глицериды, смеси липидов биологического происхождения, добавляя к ним холестерин, а-токоферол и другие минорные добавки. Потенциальная ценность искусственных мембран для исследований зависит от возможности включения в них природных белков, в особенности тех, которые обладают транспортными свойствами. Липосомы, со-стоящ ие из белков и липидов, стали получать в 60-е гг. термин протеолипосомы был введен В. П. Скулачевым. В настоящее время разработан целый ряд методов приготовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, гомогенности, стабильности и другим характеристикам. Липосомы используют для доставки в клетку лекарственных и химических соединений, стабилизации ферментов в инженерной энзимологии, введения в клеточные мембраны молекул зондов, модифицирующих и моделирующих их поверхность. Большой интерес для генной инженерии и медицины представляют работы по введению в клетки при помощи липосом нуклеиновых кислот и вирусов. В липосомы включают митохондриальные компоненты и изучают на таких модельных системах процессы генерации энергии в клетках. Ультра-тонкие искусственные мембранные структуры — полислои Лен-гмюра—Бложе (ПЛБ) — применяют для получения био- и иммуносенсоров. Создаются ПЛБ с иммобилизованными ферментами и компонентами иммунологических систем. При использовании смешанных липид-белковых пленок ПЛБ получают информацию о функционировании белков и о липид-белковых взаимодействиях в мембране. Результаты изучения физических характеристик, проводимости, проницаемости и других свойств искусственных липидных мембран имеют большое зна- [c.216]

Если холинэстераза иммобилизована с помощью ковалентного связывания, то срок службы биосенсора возрастает Так, датчик, состоящий из рН-электрода с иммобилизованной на поверхности ацетилхолинэсте-разой (путем сшивки глутаровым альдегидом с альбумином), функционирует без изменения характеристик достаточно длительное время. С его помощью определяли паратион и севин на уровне 10 - 10моль/л Продолжигельность анализа 30 мин. Содержание паратиона и севина контролировали по относительному снижению отклика сенсора после внесения в ячейку аликвоты пробы. Заметим, что величина измеиения pH зависит не только от активности фермента, но и от буферной емкости раствора. Поскольку увеличение кислотности происходит лишь на мембране, а в объеме раствора pH остается практически постоянным, обычно применяют высокие (до 0,1 моль/л) концентрации субстрата и ячейки большого (100 мл и выше) объема. Кроме глутарового альдегида для иммобилизации холинэстеразы используют сополимеры акрил- и метакриламида, желатин. В последнем случае стеклянный шарик рН-электрода погружают в 5-10%-й раствор желатина, содержащий фермент, затем высушивают и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. Аналогичные мембраны используют и в датчиках на основе рН-чув-ствительных полевых транзисторов (911. [c.294]

В медицинской диагностике ферментные показатели можно использовать для характеристики состояния различных систем организма, или применять ферменты как высокоспецифические и чувствительные тест-реактивы при проведении разнообразных клинических анализов. [c.312]

В большинстве ншвотных и растительных клеток содержится два фермента, способных окислять (+)-изоцитрат — вещество, весьма распространенное в природе. Один из них использует НАДФ, а другой — НАД. Долгое время полагали, что первый фермент, существенно более активный в гомогенатах клеток или экстрактах, и есть тот самый фермент, который непосредственно участвует в цикле лимонной кислоты. Правда, было одно смущающее обстоятельство, состоявшее в том, что основная ферментативная активность почти всегда оказывалась связанной с растворимой фракцией цитоплазмы, хотя уже в то время считалось общепринятым и отмечалось в качестве наиболее характерной особенности цикла, что все ферменты цикла локализованы в митохондриях. Положение прояснилось, когда было показано, что митохондриальные НАД-зависимые ферменты неустойчивы и обладают довольно своеобразными молекулярными и кинетическими характеристиками. Однако эти свойства были как раз такими, которых и следовало ожидать от фермента, выполняющего ключевую регуляторную роль в столь важном участке метаболизма, каким является цикл лимонной кислоты. Оказалось, что в присутствии АДФ фермент становится гораздо устойчивее. Более того, АДФ требуется ферменту для проявления полной активности при малых концентрациях субстрата. Это обусловлено резким влиянием АДФ на К, для изоцитрата. Таким образом, АДФ действует как аллостерический активатор. Существуют веские основания считать, что кроме АДФ фермент может акти- [c.353]

В настоящее время наиболее распространенными методами иммобилизации ферментов являются методы ковалентного присоединения к нерастворимым носителям. Требования, предъявляемые к свойствам нерастворимых носителей, перечень этих носителей и ряд методов для присоединения белков детально обсуждаются в гл. 8. Некоторые методы, пригодные для характеристики иммобилизованных ферментов, содержатся в гл. 9. Несмотря на то что стеклянные носители редко применяются в аффинной хроматографии, они наиболее часто используются для иммобилизации ферментов для этих целей также весьма полезными, по-видимому, могут оказаться некоторые керамические носители. Очень много данных, подкрепленных многочисленными примерами иммобилизованных ферментов, их свойств и применения, имеется в ряде обзоров и монографий [2, 15, 37, 39, 44, 57, 58]. [c.422]

За единицу активности принимается начальная скорость гидролиза КМЦ (концентрация 10 г/л), равная 1 мкмоль образующихся ВС в минуту в рН-оптимуме активности фермента при 40° С. Лля характеристики препарата используют удельную активность, т.е. активность, расчитанную на 1 г ферментного препарата. [c.147]

Остановимся на характеристике гомогенно-каталитического ферментативного катализа, который осуществляется при использовании биологических катализаторов—ферментов, представляющих собой природные белки, входящие в состав тканей. Ферментативный катализ является основой управления сложных жизненных процессов в растениях и животных организмах. Так, фотосинтез, брожение, дыхание, пищеварение, синтез белков, сокращение мышц являются каталитическими процессами, использующими в качестве катализаторов различные ферменты. [c.183]

Химические свойства и производные. Наиболее важные реакции олигосахаридов, такие как гидролиз, алкилирование, отношение к специфическим окислителям и восстановителям или к ферментам, изучаются и используются в процессе установления строения этих соединений и их синтеза. Зти вопросы освещаются в двух последующих главах, поэтому здесь мы остановимся лишь на самой общей характеристике химического поведения олигосахаридов. [c.426]

Рефрактометрия использовалась для изучения скорости тау-томерных превращений [53], гидролиза эфиров и ангидридов кислот [53, 54], некоторых газовых реакций [55] и реакций полимеризации [56—59]. В последней весьма важной области применение чисто химических методов затруднительно. Наконец, здесь следует отметить использование скорости изменения показателя преломления для характеристики каталитической активности ферментов при различных технических, биохимических и медицинских работах [60]. [c.66]

Для характеристики гликолитического механизма энергообразования часто используют величину максимального накопления лактата в артериальной крови при максимальных физических нагрузках, а также величину общего и лактатного кислородного долга, значение pH крови и показатели КОС, содержание глюкозы в крови и гликогена в мышцах, активность ферментов лактатдегидрогеназы, фосфорилазы и др. [c.477]

Комплексы, образованные координационными соединениями ионов различных металлов, хорошо изучены и широко используются. В полимерах роль лигандов выполняют боковые цепи. Особый интерес к соединениям такого типа обусловлен тем, что комплексами металлов являются многие распространенные биополимеры, такие, как металлсодержащие ферменты. Поскольку синтез, структура и характеристики таких соединений подробно описаны в специальной литературе, приведем лишь два примера, иллюстрирующие их чисто каталитическое воздействие. [c.87]

С работами Р.Вильштеттера по очистке и установлению химической природы ферментов связано также упорядочение и приведение в систему представлений об относительной активности ферментов. Зто было впервые предпринято в широком масштабе. До работ Вильштеттера определения единиц активности проводили для отдельных ферментов и использовали не столько для характеристики препаратов, сколько для практических нужд самого исследования. С работами Вильштеттера связана разработка единиц активности ферментов как одного из основных показателей, характеризующих препарат фермента. [c.134]

При постоянной концентрации фермента скорость ферментативной реакции повышается с увеличением концентрации субстрата до насыщения фермента субстратом, достигает максимальной величины и далее не увеличивается (рис. 38, б). Каждая ферментативная реакция характеризуется константой Михаэлиса (К ), определяемой как концентрация субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной. Величины и используют для характеристики каталитической способности ферментов. [c.99]

В метаболических превращениях, как правило, участвует несколько реагентов субстраты, ферменты, коферменты, кофакторы. Часто не все участвующие в реакции вещества известны. Поэтому за ходом превращения следят по изменению количества или концентрации одного, реже двух реагентов или продуктов. В таких случаях выражение скорости через концентрацию неизвестно, и время полупревращения используют как удобную кинетическую характеристику изучаемого вещества. Но при этом необходимо иметь в виду, что в отличие от константы скорости эта кинетическая характеристика может зависеть от начальной концентрации вещества. Этот факт наглядно демонстрируется выражением для времени полупревращения реакции второго порядка (9.14). В этом случае время полупревращения зависит не только от константы скорости, но так-Рис. 9.3. Кинетика реакции оседания эритро- же И ОТ концентрации [c.400]

Всего лишь 40 лет назад мысль о том, что ген можно включать или выключать, казалась абсурдной. Гипотеза, сыгравшая такую важную роль в понимании работы клеток, была выдвинута на основании изучения Е. соИ, растушей на смеси глюкозы и лактозы (дисахарид). Если бактерии предоставляли выбор источника углерода, она сначала использовала всю глюкозу и лишь затем начинала метаболизировать лактозу. Переключение на лактозу сопровождалось остановкой роста, в течение которой синтезировался фермент Р-галактозидаза, гидролизирующий лактозу до глюкозы и галактозы. Выделение и характеристика мутантных бактерий, обладающих определенными дефектами в регуляции такого переключения, дало толчок биохимическим исследованиям, которые в 1966 г. привели к идентификации и вьщелению белка-репрессора лактозного оперона. [c.183]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

Среди них наибольший интерес вызывают датчики на основе кислородного электрода. В качестве ферментных меток обычно применяют глюкозоксидазу или каталазу. На этом принципе, например, работает иммуноферментный амперометрический датчик для определения инсулина. Антитела инсулина иммобилизуют на капроновой сетке и закрепляют ее на поверхности кислородного электрода. При внесении электрода в анализируемый раствор антитела взаимодействуют с инсулином, к которому пришита глюкозоксидаза, с образованием комплексов АТ-инсулин-Е, где Е - фермент. Когда в растворе, наряду с меченым инсулином, присутствуют молекулы инсулина без фермента, то количество фермента на электроде будет тем меньше, чем выше концентрация инсулина. При внесении электрода в раствор глюкозы изменение величины тока будет соответствовать концентрации инсулина в анализируемом растворе. Кислородный электрод используется также для определения альбумина в сыворотке крови человека. Основные характеристики некоторых иммуноферментных электродов приведены в табл. 14.3. [c.506]

В любом случае полз чение экзо- и эндоферментов на определенных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения и очистки будут определяться лишь их физико-химическими характеристиками Так, при выделении экзофермента клетки продуцента становятся отходом, а культуральная жидкость или, в другом случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом Если речь идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют подходящим растворителем Полученный раствор также представляет собой полупродукт — сырец И если речь здесь идет об одном и том же ферменте, но разного происхождения и топологии (экзо-и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделенйя будут во многом тождественными В этом случае можно использовать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию, гель-хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру- [c.48]

Изменения активности некоторых белков коррелируются, как правило, с изменениями ряда физических свойств. Так, изменение формы белковой молекулы можно установить по изменению некоторых гидродинамических характеристик (например, коэффициента трения, инкремента вязкости), по изменению светорассеяния, поверхностных свойств, диффузии через полупроницаемые мембраны и скорости седиментации [90]. Изменения термодинамических свойств (энтальпии и энтропии), объема, растворимости, оптического вращения, поглощения в инфракрасной области, дифракции электронов, а также некоторые другие характеристики, приведенные Каузманом [90], используются для Оцейки изменений формы белковых молекул. Большинство этих измерений было проведено па макромолекулах неизвестной структуры, для которых не была установлена последовательность аминокислотных остатков. В настоящее время благодаря усовершенствованию методов деградации белков, аналитического определения Концевых групп, методов разделения и идентификации отдельных фрагментов можно успешно изучать белки с молекулярным весом порядка 20 ООО. Хотя эта работа еще не достигла молекулярного уровня, тем не менее она дает возможность лучше использовать значения физических констант белковой молекулы известной структуры для объяснения механизма взаимодействия фермента с субстратом. Структура такого белка, как фиброин (белковое вещество натурального шелка), в настоящее время хорошо изучена благодаря сравнению рентгенограммы и ИК-спектров нативного волокна с рентгенограммами [35, 38, 108, 140] и ИК-спектрами [168] небольших фрагментов белка известной структуры, полученных при деградации, а также синтетитегаихпмшнептидо [c.386]

Выше мы видели, что АТР и ADP являются модуляторами важных регуляторных ферментов, участвующих в гликолизе, цикле лимонной кислоты и окислительном фосфорилировании АТР действует как отрицательный модулятор, а ADP обычно стимулирует катаболизм углеводов. Вследствие этого любое изменение отношения действующих масс [ATP]/[ADP] [PJ, в норме весьма высокого, может соответствующим образом изменять также и активность некоторых регуляторных ферментов центральных катаболических путей. Имеются, однако, среди этих ферментов и такие, для которых положительным модулятором служит АМР. Чтобы оценить участие в метаболической регуляции наряду с АТР и ADP также и АМР, Даниэль Аткинсон ввел понятие энергетического заряда и использовал его в качестве одной из характеристик энергетического состояния клеток. Энергетический заряд есть мера заполнения всей аденинну-клеотидной системы (т.е. суммы АТР, ADP и АМР) высокоэнергетическими фосфатными группами [c.541]

Глюкоза+Кислород=Глюконовая кислота+Перекись водорода, тем меньше количество его регистрируется внутренней частью электрода. К сожалению, это устройство все еш.е работает недостаточно надежно, что не позволяет использовать его как имплантируемый аппарат для постоянной регистрации содержания глюкозы. Возникающие здесь проблемы связаны с наличием конкурентных отношений между глюкозой и кислородом в жидкостях тела, инактивацией фермента in vivo, сложностью калибровки и дрейфом характеристик электрода. Ведущиеся интенсивные исследования позволяют надеяться, что, усовершенствовав такие электроды с ферментами, удастся со временем создать датчик глюкозы для автономно работающего, полностью автоматического и небольшого по размеру протеза поджелудочной железы, нужного для лечения больных диабетом. В этой связи особенно интересны последние достижения в области разработки фермент-содержащих электр)рдов. Исследователи, работающие в Крзнфилдском технологическом институте Оксфордского университета и в госпитале Гая в Лондоне, разрабатывают глюкозный электрод, в котором для переноса [c.341]

В практике очистки сточных вод для характеристики напряженности окисления применяют определение дегидрогеназной активности микроорганизмов. Процесс биологического окисления, схематично показанный реакциями (4.140) и (4.141), состоит из множества ступеней и начинается с расщепления органического вещества с выделением активного водорода. Этот вид окисления называется непрямым. Водород передается ферментами дегидрогеназами на цитохромную систему дыхательной цепи ферментов, где соединяется с кислородом, образуя воду (частично перекись водорода). Количественное определение ферментов дегидрогеназ в ряде случаев позволяет получать быструю характеристику условий процесса и его особенностей и используется в качестве одного из технологических параметров управления процессом. [c.333]

Превраш ение НАД+в восстановленную форму [иногда обозначаемую как НАД-Н(+Н+)] сопровождается заметным изменением спектральных характеристик кофермента. НАД имеет максимум поглош ения около 260 ммк, причем поглощение является более слабым, чем общее поглощение аденина и никотинамида. В результате восстановления поглощение при 260 жмк значительно уменьшается и появляется новый максимум при 340 жмк, характерный для дигидроникотинамида. Изменение спектральных свойств часто используется для определения пиридиннуклеотид-зависимых ферментов. В реакциях окисления — восстановления принимает участие никотинамид-ный фрагмент этих коферментов. При восстановлении могут затрагиваться положения 2, 4 или 6 пиридинового цикла с образованием соответствующих дигидропроизводных (IX, X и XI) [c.229]

Реакционная способность ФОС в простых реакциях типа реакций гидролиза может быть без труда оценена с помощью кинетических параметров, однако при оценке реакционной способности по отношению к ХЭ возникают существенные трудности. Как известно, в большинстве отечественных и зарубежных работ в качестве меры сродства различных ингибиторов к ХЭ используется величина — опреде.ляемая опытным путем концентрация ингибитора, вызывающая снижение активности фермента на 50% (или отрицательный логарифм этой величины — р/50). Иногда вычисляется константа ингибирования К и показатель торможения К К , связанные с величино /5 определенным образом (см. ниже). Необходимо, однако, иметь в виду, что математический анализ процессов и вывод указанных констант был проведен при изучении обратимых реакций ХЭ с ингибиторами типа эзерина. Применение этих закономерностей с использованием тех же констант для характеристики необратимых реакций, каковыми являются реакции ФОС с ХЭ, представляется совершенно необоснованным. В самом деле, для обратимого торможения ХЭ, характеризующегося схематически уравнением [c.427]

Несколько другой подход используется в опытах по изучению кинетики, избирательности, обратимости и других характеристик переноса ионов при нормальных физиологических условиях цель этих исследований состоит в изучении некоторых свойств системы транспорта. Подобные эксперименты вскоре привели к созданию концепции переносчиков как агентов, ответственных за перенос. (Этот подход совершенно аналогичен тому, который использовался на заре развития биохимии, когда задолго до определения химической природы ферментов ученые смогли доказать их существование и сделать заключения о способе их действия и многих других свойствах этих биологических катализаторов.) Предполагается, что переносчики представляют собой молекулы в мембране, обра- [c.265]

Исследование пространственных, конформационных состояний. иолгипептидных и белковых молекул проводится современными физическими и физико-химическими методами. Вполне понятно, что ценность любого из этих методов будет тем большей, чем точ1нее он позволяет определять пространственное строение белка-фермента, непосредственно связанное с выполняемой последним биологической функцией. Поскольку все ферменты являются асимметрическими системами, растворы которых вращают плоскость поляризации света, то здесь широко используют оптические методы. К ним относятся дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм, т. е. изменение оптических характеристик какого-либо соединения в зависимости от длины волны облучающего света. Для многих ферментов, особенно содержащих металлы, можно применить метод магнитной дисперсии, когда оптическая активность (новая, отличная от естественной) индуцируется сильным магнитным полем (это явление известно под названием эффекта Фарадея). При изменении пространственного строения белков-ферментов в растворе меняются и их оптические характеристики — кривые оптической дисперсии и кругового дихроизма, и на основании этого можно судить о характере происшедших изменений. Широкую популярность в химии ферментов завоевали различные спектральные методы, в частности метод ядерно-магнитного резонанса, регистрирующий поведение ядер некоторых атомов в исследуемом пептиде или белке при наложении сильного внешнего магнитного поля, а также методы инфракрасной и ультрафиолетовой спектроскопии и т. п. [c.46]

Высокая чувствительность ферментов к изменению условш окружающей среды обусловила возможность использования этоп биохимического критерия для характеристики активности биоцено зов, а следовательно, для контроля работы биологических очист ных сооружений [480]. Технологический контроль за работою аэротенков рекомендуется осуществлять по дегидрогеназной актив ности биоценоза активного ила [483 — 484]. Для контроля эффек тивности очистки промышленных сточных вод могут быть использованы и другие ферменты, например фенолазы — при очистке фенольных вод. [c.280]

В тех случаях, когда методы прямого расщепления не приводят к успеху, а получение индивидуальных энантиомеров является необходимым, обычно обращаются к синтезу требуемых изомеров. В некоторых случаях превращениям свойственны свои стерические характеристики (стереоспеци-фические превращения), и они непосредственно могут дать нужные энантиомеры в других случаях d- или Z-изомеры можно синтезировать из d- или /-реагентов в некоторых ситуациях можно применять методы асимметрического синтеза, как, например, использовать оптически активные дегидратирующие агенты для дегидратации или проводить реакцию в оптически активном растворителе. Возмолшо, наиболее интересным из всех методов асимметрического синтеза является биохимический, в котором стерическая направленность обеспечивается с помощью фермента. Высокая степень или даже 100%-ная стереоспецифичность действия ферментов в химических системах хорошо известна, и это справедливо для химических процессов in vitro, так же как для процессов in vivo. Основная трудность, свойственная этому методу,— каким образом найти среди громадного разнообразия природных ферментов ТОТ) который подходит для данного превращения. По-видимому, требуется еще немалая работа в области биохимического асимметрического синтеза in vitro. [c.99]

Изоферментами называются формы фермента, различающиеся между собой первичной структурой белка и каталитической активностью. Наличие изоферментов характерно для лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, гексокиназы и других тканевых ферментов. Так, лактатдегидрогеназа, которая катализирует обратимую реакцию превращения лактата (молочной кислоты) в пировиноградную кислоту, содержится в организме человека в виде пяти изоферментов, условно обозначаемых как М , Н , МдН, MjHj, МН3. Все пять изоформ имеют одинаковую молекулярную массу (около 134 ООО), но разную каталитическую активность. Для них характерна тканевая специфичность. В скелетных мышцах преобладает тип (mus le — мышца), в сердечной мышце — тип Н (heart — сердце), в других тканях найдена комбинация этих типов. При изменении функционального состояния организма, условий среды, возраста возможно перераспределение отдельных изоформ фермента между отдельными тканями, что свидетельствует об изменении процессов обмена веществ или появлении новых изоформ. Изменение спектра изоформ или появление новых форм ферментов может использоваться при диагностике заболеваний или характеристике функционального состояния организма, в том числе при адаптации организма к физическим нагрузкам, так как при систематических тренировках могут появиться новые формы ферментов. [c.94]

Для характеристики окислительных ферментов в нейроглии зрительной коры мозга кошек использована активность ТР, которую определяли по методу Авксентьевой (1968). Закономерности, установленные для этого фермента, присущи и другим исследованным ферментным системам. [c.129]

Смотреть страницы где упоминается термин Характеристика ферментов, используемых в ИФА: [c.373] [c.231] [c.165] [c.64] [c.89] [c.196] [c.252] [c.127] [c.39] [c.302] [c.412] [c.103] [c.205] [c.96] [c.126] [c.232] [c.412] [c.49] [c.68] [c.160]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология