Фермент стабилизация конформации

Наибольшие успехи в стабилизации ферментов связаны с применением метода иммобилизации. В общем случае можно указать по крайней мере три причины изменения стабильности в результате иммобилизации 1) изменение конформации иммобилизованного фермента по сравнению с нативной структурой [c.128]

Ион металла может участвовать в присоединении субстрата, собственно в катализе, в стабилизации оптимальной конформации молекулы фермента и т. д. (табл. 2.2). Подробнее о роли ионов различных металлов в ферментативных превращениях см. главу 4. [c.95]

Крахмал и лактоза замедляют скорость поглощения ферментными препаратами водяных паров. Наполнитель, используемый для стандартизации препаратов ферментов, не должен необратимо ингибировать ферменты. Крахмал оказывает стабилизирующее действие при хранении амилолитических ферментов. Показано, что после стандартизации препаратов пектолитических ферментов диатомитом, бентонитом или желатином ферментативную активность (пектиназы) следует определять после растворения препарата не в воде, а в буферном растворе с pH 3,5—4,0, что способствует десорбции фермента (аллостерического центра) с поверхности контактных участков наполнителя, т. е. возможна обратимость аллостерической специфичности. В отдельных случаях возможна необратимость конформации аллостерических участков (действие аммонийных солей на амилолитические ферменты). Наполнители могут вызывать также стабилизацию аллостерических участков (стандартизация крахмалом амилолитических ферментов). [c.170]

Атомы многих металлов также стабилизируют пространственную конформацию ферментных и иных белков. Таким действием обладают катионы Са, 2п, Мп, Mg, Со, Сп, Ре + 2, иногда Ва и также трехзарядные катионы. Они обеспечивают сохранение третичной и (или) четвертичной структуры ферментов. Особенно часто встречается стабилизирующее действие иона кальция, который защищает конформацию а-амилазы, предохраняет от денатурации (и автолиза) трипсин, защищает лизоцим, бактериальные и грибные протеиназы, некоторые пептидазы. Металл, по-видимому, может стабилизировать фермент двумя путями входя в состав его активного центра (у истинных метал-лоэнзимов) или присоединяясь к различным иным участкам на поверхности белковой частицы. При стабилизации апоферментов, например ионами Са, вероятно образуются клешневидные связи между металлом и СОО-группами. [c.166]

В роли кофактора могут выступать ионы различных металлов (табл. 2.1). Ион металла может участвовать в присоединении субстрата, собственно в катализе, в стабилизации оптимальной конформации молекулы фермента, в стабилизации четвертичной структуры. Активность металлозависимых ферментов после удаления металла либо утрачивается полностью, либо заметно снижается. [c.69]

Применение межмолекулярно сшитых ферментов для терапевтических целей преследует те же цели, что и в случае полимер-ферментных конъюгатов увеличение сроков циркуляции в кровяном русле, снижение иммуногенности и стабилизацию фермента при максимальном сохранении ферментативной активности. В отсутствие полимерной защитной оболочки достижение этих целей более сложно. В то же время нарушение нативной конформации белка при межмолекулярном сшивании обычно меньше, чем при модификации полимерами, содержание белка в конъюгате почти 100 %, а внутримолекулярные сшивки ответственны за наблюдаемую в ряде случаев стабилизацию. [c.199]

При денатурации не происходит разрыва ковалентных связей, рвутся лишь водородные и другие слабые связи, участвующие в стабилизации конформации фермента, соответствующей активной форме. Хотя все эти связи существенно слабее ковалентных (знергия водородной связи составляет 20 кДж моль в то время как энергия ковалентной связи равна приблизительно 400 кДж -моль ), следует учитывать, что денатурация обычно сопровождается разрывом большого числа слабых связей. Позтому стандартное изменение энтальпии (АЯ°) для реакции денатура- [c.156]

Сольвофобные взаимодействия играют важную роль в ассоциации полиметиновых красителей [81] ив стабилизации определенных конформаций полипептидов и белков в водных растворах [222, 223]. Они участвуют и в образовании фермент-субстратных комплексов [77, 78, 83, 84]. [c.54]

Гидрофобные взаимодействия возникают в белке, находящемся в состоянии клубка. В том случае, когда большинство связей, стабилизующих вторичную структуру, разорвано, даже малое число гидрофобных взаимодействий играет решающую роль в стабилизации конформации. Нужно еще отметить, что наличие гидрофобных групп в белковой молекуле, вполне возможно, является не только фактором, стабилизирующим нативную пространственную структуру, но и имеет непосредственное значение для каталитического акта. Как подчеркнул Перутц [87], неполярная среда с низкой диэлектрической проницаемостью, возможно, усиливает электростатические взаимодействия субстрата с полярными группами фермента, увеличивая тем самым скорость химических реакций. В работах Березина и Мартинека с сотр. [88] обнаружено, что гидрофобным взаимодействиям принадлежит главная роль при связывании конкурентных ингибиторов а-химо-трипсином. [c.19]

Гидрофобное взаимодействие имеет большое значение для образования мицелл и стабилизации определенных конформаций полипептидов и протеинов в водном растворе, а также играет, вероятно, важную роль при образовании биохимических комплексов фермент-субстрат [49]. [c.24]

Метиониновые остатки могут придавать молекуле белка гидрофобные свойства, что играет важную роль в стабилизации активной конформации ферментов в солевом окружении. [c.243]

Находящийся в клетке ингибитор связывается с конформером А и при достаточно высокой концентрации переводит весь фермент в неактивную форму А. Фермент оказывается выключенным или по крайней мере обладает очень низкой активностью. Прн высоких же концентрациях активатора фермент будет включен за счет стабилизации конформации В. Доля молекул фермента, находящихся в активной форме В, определяется концентрацией ингибитора, активатора и субстрата в клетке в данный момент времени. Подобное соотношение между ингибированием и активацией лежит в основе многих явлени11 регуляции клеточного метаболизма (гл. 1, разд. Е). [c.36]

Таким образом, результаты этих опытов показывают, что конформация молекулы, обусловливающая ее ферментативную активность, полностью определяется последовательностью аминокислот в полипептидной цепи. Для того чтобы остатки цистеина соединились правильно, пе нужно никакого специального фермента. Образование специфических дисульфидных связей требуется, по-видимому, лишь для стабилизации активной конформации, а не для ее возникновения. В результате восстановления и последующего окисления рибонуклеазы образуется продукт, имеющий ту же ферментативную активность, ультрафиолетовый спектр, характеристическую вязкость, дисперсию оптического вращения и те же иммунологические свойства, что и нативный фермент. Пептидные карты, получаемые после ферментативного расщепления этих двух веществ, также идентичны. Если 6l.i расположение дисульфидных связей в нативной и реконструированной рибонуклеазе было различным, пептиды, содержащие такие связи, не могли бы попасть, на одинаковые места карты. [c.279]

Предложено много гипотез, касающихся роли ионов металла в ферментативных реакциях. Не рассматривая эти гипотезы подробно, отметим основные общие положения 1) металл способствует связыванию субстрата с ферментом и входит в состав активного центра 2) комплекс металла с субстратом является фактически активированным субстратом и 3) образование комплекса между металлом и функциональными группами белка способствует поддержанию третичной структуры белка в конформации, необходимой для выполнения каталитической функции. Клотц [187], основываясь на данных об участии ионов металлов в связывании ииркдпн-2-азо-л-диметиланилина сывороточным альбумином быка, предположил, что для пептидаз, требующих наличия нона Мп(П) — слабого комплексообразователя, роль иона металла состоит не в связывании субстрата в основном состоянии. Он полагал, что один из возможных механизмов катализа включает стабилизацию промежуточного тетраэдрического соединения по следующему механизму [c.125]

Несмотря на некоторое сходство, эти два белка имеют совершенно разную конформацию, что еще раз подчеркивает важную роль аминокислотной последовательности и размера цепи в определении конкретной структуры. Рассмотрим сначала лизоцим (129 остатков), морфология которого может быть описана вытянутым эллипсоидом (45 х 30 х 30 А) с удаленной клинообразной областью. Образовавшаяся щель представляет собой активный центр фермента. Молекула содержит лишь небольшое число участков, подобных а-спирали (остатки 5 — 15, 24 — 34, 88 — 96), и несколько более коротких участков, остатки которых имеют почти такие же углы фиф, как и у а-спирали или 3,о-спирали . Важная особенность структуры — наличие -слоя (рис. 5.18). Он образован тремя антипараллельными цепями (остатки 42 — 48, 49 — 54 и 57 — 61), связанными водородными связями, в которых участвуют амидные и карбоксильные группы, а также атомы боковых цепей серина, треонина, аспарагина и глутамина. Некоторые из перечисленных боковых групп принадлежат не остаткам самого -слоя, а остаткам, расположенным дальше по цепи. Считается, что эта 3-структура играет очень важную роль в определении нативной конформации фермента и ее стабилизации. Сомнительно, однако, чтобы указанная область со столь большим числом поперечных водородных связей была так же важна для формирования структуры в целом, как гидрофобные взаимодействия, поскольку сама молекула белка может денатурировать в водном растворе мочевины. [c.275]

Еще 10 лет тому назад Н. Д. Иерусалимский — крупный советский микробиолог— писал Некоторые этапы химических синтезов трудны и сопровождаются образованием большого числа изомеров и побочных продуктов. В таких случаях полезную услугу могут оказать ферментные препараты или живые носители ферментов — микроорганизмы. От небиологических катализаторов они выгодно отличаются специфической направленностью своего действия. К тому же вызываемые ими биохимические процессы протекают при обычных температурах и давлении. Их осуществление не требует ни антикоррозийной аппаратуры, ни крупных энергетических затрат . В значительной мере благодаря его инициативе в СССР были начаты интенсивные исследования в области инженерной микробиологии. Однако, как уже говорилось выше, применение микроорганизмов в целях направленной трансформации органических веществ существенно ограничивалось спецификой работы с микроорганизмами или выделенными ферментами, которые требовали специальных условий для получения, сохранения и воспроизводства. В настоящее время известны пути стабилизации (иммобилизации) ферментов путем либо химической фиксации активной конформации с помощью дифункциональных (сшивающих) реагентов, либо химической прививки к полимерным носителям и даже к стеклу, либо включения в гель инертного полимера. Это позволило превратить ферменты из крайне нестойких веществ в довольно стабильные, препараты, которые могут неоднократно вводиться в реакционную массу в качестве катализатора. Более того, стало возможным, не выделяя фермент, проводить такую иммобилизацию прямо на клеточном уровне, используя выращенную культуру соответствующего микроорганизма. Все это позволяет рас-сч1итывать в ближайшие годы на широкое и эффективное В1недрение методов ферментативного превращения не только в лабораторную, но и в промышленную практику. Именно поэтому мы надеемся, что появление даже неполной сводки, составленной американскими специалистами, вызовет интерес у советского читателя. [c.6]

Mg (или Мп ), изоцитратдегидрогеназа, малатдегидрогеназа (декарбокси-лирующая) и ряд других ферментовионы Мп " . Для стабилизации специфической конформации, обусловливающей максимальную каталитическую активность многих других ферментов, необходимы, по-видимому, одновалентные ионы, такие, как Na+, К+ или КЩ. [c.181]

Оба этих пограничных механизма пригодны для объяснения катализа лизоцимом. Группа карбоновой кислоты в активном центре фермента, по-видимому, передает протон уходящему атому кислорода. Это можно рассматривать либо как общекислотный катализ, либо как стабилизацию протонированной уходящей группы карбоксилатным ионом. Карбоксилатная группа в активном центре может ускорять реакцию или обеспечивая электростатическую стабилизацию образующегося иона карбония, или помогая замещать уходящую группу [92]. Первое предположение кажется более предпочтительным, поскольку организация атомов на активной поверхности фердшнта препятствует обычному 8 к2-замещению с линейным переходным состоянием, в то время как перевод субстрата в конформацию полукресла обеспечивает дополнительную стабилизацию образующегося иона карбония. Тем не менее трудно провести четкое разграничение между ионом карбония, стабилизированным соседней карбоксилатной группой [Ха, схема (88)], и напряженной связью между атомом углерода 1 и карбоксильной группой (Хб) [c.184]

Концепция, согласно которой активный центр фермента уменьшает свободную знергию активации, обеспечивая максимальное связывание для переходного состояния, шире, чем термины напряжение или искажение . Невозможно, однако, провести четкую грань между различными механизмами, сущность которых заключается в использовании энергии связывания субстрата для уменьшения свободной энергии активации реакции. Так, электростатическая дестабилизация пиридина или тиоэфира отрицательным зарядом может осуществляться лишь в том случае, если эти группы приходят в соприкосновение с отрицательным зарядом за счет связывающих сил остальной части молекулы. Даже обычный тип папря кения трудно отличить от механизма индуцированной ориентации реагирующих групп каждая данная молекула проводит разное время в различных конформациях, зависящее от энергий и энтропий каждой конформации, и связывание на активном центре одной из этих конформаций, которая легче всего ведет к образованию переходного состояния, оплачивается менее предпочтительной свободной энергией связывания. Так как ускорение реакции зависит от стабилизации связыванием такой особой конформации, то совершенно безразлично, вызы вается ли малая вероятность этой конформации за счет неблагоприятной энтропии или энтальпии. Представление об оптимальном связывании переходного состояния можно даже использовать для объяснения увеличения скорости, которое является результатом сближения двух реагентов из разбавленного раствора на активном центре. [c.227]

Эти факты становятся понятными при изучении кристаллографической структуры молекулы фермента и химии катализируемой реакции. Как было описано в гл. 3, разд. Д,3, расщепление у С-1 атома углерода гексозы. связанной с центром В, протекает, по всей вероятности, при участии карбокси-латного иона и карбоксильной группы активного центра фермента через переходное состояние, которое имеет некоторое сходство со структурой иона карбония. Существование реакций переноса на специфические акцепторы с сохранением конфигурации С-1 атома углерода показывает, что распад этого переходного состояния ведет к образованию промен<уточного соединения аналогичной структуры с временем жизни, достаточным для того, чтобы уходящая группа могла диффундировать с центра Е и заместиться молекулой акцептора [30, 32]. Образование похожего на ион карбония переходного состояния требует искажения гексозного кольца из конформации кресла (XIII) в конформацию полукресла (XIV) с тем, чтобы произошла резонансная стабилизация нри взаимодействии положительного заряда атома углерода и соседнего атома кислорода. Данные рентгеноструктурного анализа и результаты, описанные выше, показывают, что фермент снижает энергию, необходимую для достижения переходного состояния, путем принудительного перевода гексозного кольца на центре В в конформацию полукресла. Этот процесс представляет собой превращение энергии связывания в энергию напряжения или деформации, понижающее энергию активации. [c.239]

На рис. 1.21 приведены проекции пространственной структуры одной из субъединиц в нативном димерном ассоциате, на рис. 1.22 - расстояния между атомами аминокислотных остатков той же структуры (так называемая карта Кунтца, дающая представление о сближенности остатков в конформации белковой молекулы). Из рис. 1.21 и 1.22 видно, что первые девять N-концевых и последние шесть С-конце-вых остатков последовательности не взаимодействуют друг с другом и с остальной частью молекулы из-за своей удаленности. Развернутые конформационные состояния этих фрагментов наиболее благоприятны для межмолекулярных взаимодействий, которые они осуществляют в структуре каталитически активного димера HIV-1 протеиназы (рис. 1.18 и 1.19). Выше отмечалось, что именно межмолекулярные контакты четырех концевых групп двух последовательностей вносят основной вклад в стабилизацию димера. В то же время развернутые формы участков 1—9 и 94—99 энергетически невыгодны для свободных молекул фермента, и их реализация в разбавленном растворе маловероятна. Следовательно, в процессе димеризации должен происходить конформационный переход от свернутых форм, выгодных для свободных молекул, к развернутым, предпочтительным для ассоциированных. Из рис. 1.21 и 1.22 столь же очевидно, что одновременно должно изменяться также конформационное состояние флепа 45—57, которое в комплексе определяется взаимодействиями с флепом второй молекулы и, возможно, с димером смежной элементарной ячейки. [c.91]

Еще более вероятным кажется предположение, что при связывании остатка нуклеозида субстрата с некоторым участком фермента происходит конформационная перестройка последнего, в результате чего формируется конформация активного центра, необходимая для ферментативной реакции. Наконец, возможно, что необходимой предпосылкой для образования фермент-субстратного комплекса является такая конформация НДФС, при которой гетероциклическое ядро нуклеозида и остаток сахара сближены, и гетероциклическое ядро непосредственно участвует в ферментативной реакции. Такое участие может быть связано со способностью оснований нуклеиновых кислот выступать в качестве доноров или акцепторов протона или восстанавливаться (служить акцепторами гидрид-иона). Функциональные группы нуклеиновых оснований могут образовывать водородные связи с гидроксильными группами остатка сахара, что приводит к стабилизации определенных конформаций последнего и к созданию благоприятных стереохимических условий для определенных химических процессов. [c.184]