Скрининг по активности белка

Скрининг по активности белка [c.69]

Основой развития фармацевтической промышленности до недавнего времени был скрининг микроорганизмов и синтетических химических веществ. Появление новейших методов химического синтеза генов, возможно, позволит пойти другим путем конструирования случайных нуклеотидных последовательностей, их клонирования и оценки биологической активности соответствующих белков и пептидов. Хотя занятие это можно уподобить написанию сонета Шекспира группой печатающих [c.321]

Способы получения требуемых последовательностей нуклеотидов из клонотек генов можно разделить на три группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на присутствие в них искомых последовательностей нуклеотидов путем последовательного перебора случайных клонов. При таком подходе, получившем название скрининга, творческие усилия исследователя направлены только на облегчение самого процесса анализа клонов, например, на его автоматизацию. Во втором случае, присутствие нужных последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах бляшек продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности, т.е. определенного фенотипа, который отличает такие клоны от соседних, не содержащих соответствующих последовательностей. В этом случае исследователь среди большого количества суммарных клонов осуществляет выбор тех, которые резко отличаются от соседних по своему фенотипу, например, цвету колоний. При таком подходе производится выбор требуемого фенотипа среди большого числа других фенотипов. Реализация третьего подхода требует создания селективных условий, при которых преимущество в размножении получают те клоны, которые отвечают требованиям отбора, например, приобрели способность к росту на селективных питательных средах в присутствии антибиотика или в отсутствие аминокислоты в случае исходно ауксотрофного штамма. Последний подход, кроме своего необыкновенного изящества в замысле, демонстрирует самую высокую эффективность, так как позволяет в одно касание освободиться от всех нежелательных примесей в виде ненужных клонов. [c.162]

До появления клонотек пептидов улучшение их биологических свойств осуществляли путем последовательного синтеза большого числа аналогов и проверкой их биологической активности, что требовало больших затрат времени и средств. В последние годы появилась возможность с помощью автоматических синтезаторов создавать за короткое время тысячи различных пептидов. Разработанные методы направленного мутагенеза также позволили резко расширить число белков, получаемых одновременно и последовательно тестируемых на биологическую активность. Однако только недавно разработанные подходы к созданию клонотек пептидов привели к получению миллионов последовательностей аминокислот, требуемых для проведения эффективного скрининга с целью выявления пептидов, максимально удовлетворяющих предъявляемым критериям. Такие клонотеки используются для исследования взаимодействия антител с антигенами, получения новых ингибиторов ферментов и антимикробных агентов, конструирования молекул, обладающих требуемой биологической активностью, или придания новых свойств белкам, например, антителам. [c.337]

Следующий после создания библиотеки этап -это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующим радиоав-тографическим анализом, иммунологический скрининг и скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью. [c.64]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

Термин деформатор был введен для соединений, вызывающих локализованное, довольно ограниченное конформационное изменение в белке, полностью и легко обратимое при удалении этого соединения. Разным белкам соответствуют различные специфические деформаторы , и в литературе описаны многочисленные примеры ферментов, которые особенно чувствительны к специфическим катионам, анионам или незаряженным соединениям. Их влияние на структуру фермента часто выражается в обратимой инактивации последнего (изменение значений Кт или Кмакс, или И ТОЙ И другой величины), в изменении агрега-ционного состояния или констант связывания фермента с определенными лигандами. Такого рода соединения очень часто упоминаются в сообщениях об оптимизации методики определения активности данного фермента и относятся к неконкурентным ингибиторам, которые не должны присутствовать в аналитической пробе. Некоторые из этих соединений могут действовать как специфические деформаторы , вследствие чего следует провести скрининг с помощью пробного набора для определения их эффективности как элюентов. [c.184]

Возникновение ложноположительных клонов особенно вероятно в первых раундах отбора белков, эволюционирующих in vitro, когда их активность еще слабо выражена, и для ее обнаружения приходится использовать высокочувствительные гены-репортеры. Часто клетки, выжившие во время такого отбора, не содержат белков, взаимодействующих друг с другом, а являются мутантами, которые обладают искомым фенотипом. Помимо этого, найдется множество других причин, по которым могут вырасти фоновые колонии клеток дрожжей. Подробное описание подходов и конкретных методов, с помощью которых можно снизить влияние ложноположительных клонов на общий исход эксперимента, можно найти в специальных руководствах [132]. Здесь же отметим, что для успешного решения задач по отбору белков в ходе направленной эволюции, необходимо на основании данных литературы выбрать формат оптимальной системы Y2H, в котором соблюден баланс между чувствительностью системы и ее устойчивостью к посторонним шумам. Выводы о взаимодействии белков друг с другом можно делать лишь по степени воспроизводимости результатов с несколькими генами-репортерами. Положительные клоны, полученные при первичном скрининге, должны исследоваться в новом раунде отбора. При этом во вторичном скрининге часто используют систему la Z с геном (3-га-лактозидазы в качестве репортера. Само собой разумеется, что на всех этапах проведения отбора необходимо ставить контрольные пробы, так как весь опыт экспериментальной работы показывает, что лучше поставить десять лишних контролей, чем не поставить одного нужного. Ведь в случае ошибки потери времени будут несопоставимы со временем, затраченным на постановку контрольных экспериментов. [c.364]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология