Реассоциация ДНК, кинетика

Рис. 107. Кинетика реассоциации денатурированных препаратов ДНК. (Значения Со/ (скорости реассоциации) отложены в логарифмическом масштабе.)

Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментированной ДНК, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15-98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть этих последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК. Примером таких уникальных последовательностей являются интроны, появление которых в геноме эукариот пока не нашло своего объяснения [6]. [c.24]

С помощью колонок с гидроксилапатитом можно исследовать кинетику реассоциации денатурированных фрагментов ДНК [56]. Работу в этом случае осуществляют в следующей последовательности 1) фрагментированную ДНК денатурируют нагреванием в 0,12 М фосфатном буфере pH 6,7 при 100° в течение 10 минут, 2) фрагментированную и денатурированную ДНК инкубируют при 60° в течение различных промежутков времени (от нескольких минут до нескольких часов) 3) ин- [c.90]

Кинетика реассоциации денатурированной ДНК 186 [c.351]

Очень ценным является изучение кинетики реассоциации фрагментированной денатурированной ДНК [92—95]. Этот процесс подчиняется кинетике второго порядка (гл. 6, разд. А.З), описываемой уравнением (2-16). Его легко получить, проинтегрировав уравнение (6-8) в интервале от О до при [А] = [В] =С. [c.144]

Рис. 17.3. При исследовании кинетики реассоциации эукариотической ДНК в ней обнаруживаются три тина комнонентов (обозначенных закрашенными областями).

С. Эта величина может быть измерена химически и выражена в пикограммах (пкг) ДНК или определена методом исследования кинетики реассоциации ДНК (см. ниже), когда ее обычно выражают в парах нуклеотидных оснований или даль тонах. Соотношение между этими величинами таково 1 пкг = 0,965 10 п. н. = 6,1 -10 дальтон. Величина С колеблется в огромных пределах от такого маленького значения, как всего лишь 10" п.н. у микоплазмы, до такого большого, как 10 п.н. у некоторых растений и амфибий. [c.222]

Реассоциация двух комплементарных последовательностей ДНК происходит путем спаривания оснований-в отличие от процесса денатурации, при котором они разделяются (см. рис. 2.15). Мы уже рассмотрели многие эксперименты, в основе которых лежит использование этого метод для выделения индивидуальных последовательностей ДНК или РНК и их способности гибридизоваться со специфическим зондом. Сейчас мы увидим, что кинетика реассоциации отражает разнообразие присутствующих в клетке последовательностей, причем эта реакция может быть использована для определения количества генов и их РНК-продуктов. Такие реакции при их проведении в растворе называются гибридизацией в растворе. [c.224]

Когда ДНК эукариотического генома характеризуют с помощью кинетики реассоциации, значения Сд реакции обычно находятся в пределах, различающихся на 8 порядков. Это гораздо более широкий диапазон, чем 100-кратный диапазон, которого можно было бы ожидать, исходя из уравнения 2, и который показан на рис. 17.2. Причина состоит в том, что уравнение описы- [c.224]

Сложность медленно ренатурирующей фракции ДНК соответствует ее размеру. Предположим, что определенное химически содержание ДНК в гаплоидном геноме, реассоциация которого показана на рис. 17.3, составляет 7,0-10 п.н. Тогда 45% этой величины составят 3,15-10 п. н., что только ненамного превышает величину 3,0 -10 п. н., определенную в соответствии с кинетикой реассоциации. Действительно, с учетом ошибок измерения каждого из этих двух методов можно утверждать, что значения сложности медленно ренатурирующей фракции, определяемые как химическим, так и кинетическим методом, одинаковы. Соответствующие величины называются химической сложностью и кинетической сложностью. [c.225]

На рис. 17.4 приведена зависимость между размером генома, определенным по кинетике реассоциации неповторяющейся ДНК, и содержанием ДНК на гаплоидный геном, определенным с помощью химического анализа. Данные хорошо согласуются. Это подтверждает высказанное выше предположение о том, что неповторяющаяся ДНК действительно состоит из индивидуальных последовательностей, присутствующих в геноме в виде только одной копии. [c.226]

При изучении кинетики реассоциации ДНК эукариотического генома фракции индивидуальных последовательностей редко разделяются так же хорошо, как это показа- [c.227]

Реассоциация двух сходных, но не идентичных последовательностей происходит медленнее, чем реассоциация идентичных последовательностей. Это означает, что для реассоциации сходных последовательностей требуется большее значение Поэтому значения Со 1/2, наблюдаемые для фракций повторов, могут быть выше, чем это соответствует их действительной сложности. Таким образом, большинство фракций повторяющихся последовательностей имеют более низкие значения сложности и большую частоту повторяемости, чем это следует из кинетики их реассоциации. Мы увидим, что это особенно характерно для высокоповторяющейся ДНК (гл. 24). [c.229]

Рассматривая эту проблему с другой стороны, можно задать вопрос о том, что мы знаем о коротких последовательностях, повторяющихся в геноме в виде идентичных или сходных копий. Конечно, это приведет нас к определению повторяющейся ДНК по характеру кинетики ее реассоциации, как описано в гл. 17. Резюмируя все сказанное, можно утверждать, что фракция умеренных повторов состоит из множества семейств после- [c.298]

Эту фракцию иногда называют ДНК, ренатурирующей в нулевой момент времени, поскольку в реакции реассоциации она обнаруживается в виде двухцепочечных молекул, по существу, в момент времени, равного нулю. Обычно ее удаляют до определения кинетики реассоциации других фракций ДНК. (Это означает, что ДНК денатурируют, а затем двухцепочечные молекулы удаляют хроматографией на гидроксиапатите, после которой инкубируют одноцепочечную ДНК для осуществления реакции реассоциации второго порядка.) [c.299]

КИНЕТИЧЕСКАЯ СЛОЖНОСТЬ. Сложность последовательностей некоторой фракции ДНК, определяемая по кинетике реассоциации. [c.522]

НЕПОВТОРЯЮЩАЯСЯ ДНК. Характеризуется кинетикой реассоциации, свойственной уникальным последовательностям. [c.523]

Начальная реассоциация цепей ДНК в растворе происходит по типу кинетики второго порядка [c.147]

Дополнительная информация, касающаяся кинетики реассоциации и кривых ot, содержится в работах [1, 12, 19, 51, 59]. [c.150]

ДНК в данном случае скорость реассоциации зависит от числа идентичных (или почти идентичных) повторов. Наконец, имеются еще уникальные последовательности ДНК (единичные копии), кинетика реассоциации которых сходна с таковой для бактериальной ДНК (рис. 2.78). [c.115]

Впервые диспергированные повторяющиеся последовательности были обнаружены при изучении кинетики реассоциации. Эти исследования показали, что высокоповторяющиеся последовательности часто бывают встроенными в другие последовательности ДНК. [c.198]

Рис. 107. К нетика реассоциации денатурированных препаратов ДНК. (Зна-чения Со/ (скорости реассоциации) отложены в логарифмическом масштабе.) в — значения ot tt уменьшаются обратно пропорционально содержанию ДНК в геномах ага и бактерии б — кинетика реассоциации ДНК тимуса теленка, стрелки указынают значения для фракций генома.

НО исследовать кинетику реассоциации однонитевых денатурирован-ных фрагментов ДНК, определяя в каждый данный момент реакции количество ренатурировавшей двуспиральной ДНК- Кинетические параметры реакции количественно характеризуют степень разнообразия последовательностей ДНК, или сложность ДНК (рис. 107, а). Скорость реассоциации ДНК пропорциональна at(v=K t), где Со — молярная концентрация нуклеотидов ДНК t — вре.мя, с. Значение oiVj, когда реассоциирует 50 % ДНК. характеризует степень сложности генома.Оказывается, что значение l U для ДНК Е. соИ < 9) примерно в 30 раз больше, чем для ДНК фага Т4 (3-10- ). Действительно, содержание ДНК в клетках . сой (5-10 п-н.) также в 30 раз больше, чем в составе частицы фага (1,7-10" п. н.). Сложность ДНК определяется общей длиной (в нуклеотидных парах) разных последовательностей ДНК. содержащихся в исследуемом образце ДНК. С увеличением степени полиплоидиза-ции сложность геномной ДНК, как и кинетика реассоциации, меняться не будет. [c.187]

При исследовании реассоциации ДНК эукариотической клетки выявляются аномалии кинетики реакции (рис. 107, б). Например, на кривой реассоциацин ДНК из тимуса теленка можно различить ступеньки, которые отражают отдельные этапы реакции. Первая ступенька указывает на наличие быстро ренатурирующей фракции 1 (25 % ДНК). Следующая соответствует фракции 2, ренатурирующей со средней скоростью (30 % ДНК) и, наконец, остальная часть ДНК (45 %), предстаменная фракцией 3, ренатурирует медленно. Количество ДНК во фракции может быть определено исходя из значения oiVj. Так, например, значение для фракции 2 (1,9) Почти в 5 раз ниже ее значения для ДНК Е. соИ. В таком случае сложность фракции 2 составляет всего 10 п. н. В то же время коли- [c.187]

Рис. 17.5. При исследовании кинетики реассоциации ДНК 5. ригригаШз можно выделить несколько компонентов. Экспериментальная кривая проведена через точки, соответствующие из-

Ренатурация основной части ДНК любого генома представляет собой бимолекулярную реакцию, протекающую в соответствии с кинетикой реакции второго порядка, описанной в гл. 17. Это относится к ренатурации неповторяющейся, умеренно повторяющейся и высокоповторяющейся фракций ДНК. Но обычно имеется также и другая фракция, реассоциирующая значительно быстрее, чем высокоповторяющаяся ДНК. Эту фракцию получают в виде двухцепочечных структур даже при самых коротких временах реассоциации. Будет, конечно, преувеличением сказать, что она реассоциирует мгновенно , но реакция действительно протекает чрезвычайно быстро при значениях СоГ менее или 10 . [c.299]

Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ и фрагментов ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. oli очень близка к теоретической кривой, представленной на рис. 9.2, что указывает на то, что ренатурация ДНК происходит при единственном неизменном значении константы скорости реакции f j- Напротив, график кине-

Трансформация — важный метод генетического анализа, так как имеющиеся в природе способные к трансформации виды не имеют систем конъюгации, и только небольшое число видов имеет хорошо развитые системы трансдукции. В аспекте фундаментальной науки трансформация позволила составить представление о механизме генетической рекомбинации [25, 31], а в случае Ba illus subtilis ее изучение способствовало получению информации о начале и направлении репликации хромосомы [18]. Данные экспериментов по внутривидовой и межвидовой трансформации использовались также для определения степени генетического родства между определенными участками генома [31]. Такой подход стимулировал изучение родства с использованием анализа кинетики реассоциации ДНК (гл. 22) и новейших методических приемов при исследовании рекомбинантной ДНК. Использование трансформации и трансдукции тесно связано с методологией изучения рекомбинантной ДНК, где благодаря искусственной индукции компетентности возможно введение рекомбинантных молекул в клетки различных видов бактерий. [c.80]

Сателлитные последовательности у быка и мыши. У быка известны восемь разных сателлитных последовательностей (рис. 9.28). Все вместе они составляют более 23% геномной ДНК и, судя по кинетике реассоциации, занимают промежуточное положение между высоко- и умеренноповторяющимися последовательностями (см. разд. 9.1.6). Повторяющиеся единицы представлены набором взаимосвязанных последовательностей. Секвенирование показало, что по меньшей мере пять из восьми сателлитов содержат одну или более одинаковых последовательностей, хотя и дивергиро-вавших настолько, что не гибридизуются между собой, а рестрикционный анализ не выявляет их родства. Длина повторяющейся единицы у большинства сателлитов быка превышает 1 т. п. н. Внутри этих длинных повторяющихся единиц имеются повторы, встречающиеся более часто. [c.192]

Анализ кинетики ассоциации. На кривых реассоциации геномной ДНК повторяющимся последовательностям соответствуют участки с низким и средним значениями ot, а уникальным участок с высоким ot (гл. 7.5.6). Если для определения доли реассоциированной ДНК используется гидро-ксилапатит, то двухцепочечными считаются как частично, так и полностью ренатурировавшие молекулы (рис. 9.34). В результате мы получаем кажущееся увеличение доли геномной ДНК, реассоциирующей при низких и средних значениях ot, при увеличении длины фрагментов ДНК. Это происходит потому, что повторяющиеся последовательности, которые реассоциируют при относительно низких ot, рассеяны по геному среди последовательностей с низким числом копий (рис. 9.35). В опытах, о которых идет речь, определяется зависимость доли ДНК, считающейся двухцепочечной по данным связывания с гидроксилапатитом, от длины фрагментов ДНК. Чтобы получить препараты молекул ДНК разной длины, суммарную ДНК фрагментируют случайным образом и затем разделяют по размерам центрифугированием в градиенте плотности. Фрагменты денатурируют и отжигают при фиксированных значениях ot, слишком низких для реассоциации уникальных одно-копийных последовательностей. [c.198]

Классический анализ кинетики реассоциации показал, что для геномов человека и других млекопитающих характерно присутствие коротких, часто встречающихся повторов. Об этом же свидетельствуют те данные на молекулярном уровне, которые были получены с помощью рестрикцион- [c.200]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология