Секвенирование

Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химического метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нуклеотиду на 5 -конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) проводят анализ послойно всех дорожек

В настоящее время существует множество вариантов как метода Максама — Гилберта, так и метода Сэнгера. Главное, эти методы удалось полностью автоматизировать. Так, например, при секвенировании ДНК по Сэнгеру на 5 -конец праймера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырех анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками. После электрофоретического разделения гель сканируется при четырех различных длинах волн и полученная информация сразу обрабатывается на ЭВМ. При этом все биохимические операции также проводятся роботом. [c.19]

ДНК-полимеразной реакции (рассуатриваемой в гл. II при обсуждении репликации ДНК). Принцип метода показан иа рис. 7. Как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту, здесь добиваются, чтобы обрыв цепи (при попадании на ее З -конец комплементарного терминаторного нуклеотидного остатка) происходил равновероятно по всем положениям данного остатка (рис. 7 — остаток Т). Это достигается экспериментальным выбором правиль ного соотношения дезоксинуклеозидтрифосфатов и терминаторного [c.18]

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность полипептида. [c.106]

Для секвенирования ДНК по Сэнгеру созданы универсальные конструкции (на базе генома фага М13) для встраивания в них изучаемого фрагмента , позволяющие применять универсальный праймер. Метка вводится в праймер или по а-фосфатной группе нуклеозидтрифосфата, В последнем случае это может быть не только меченый атом фосфора ( Ф, например), но и атом серы ( 5), заменяющий атом кислорода [c.19]

Наряду с химическим расщеплением секвенирование РНК можно проводить путем гидролиза ее цепи специфическими РНК-азами. [c.20]

Появление эффективных методов секвенирования привело быстрому накоплению данных о локализации мутаций последовательностях ДНК. Однако, механизмы влияня полинуклеотидного контекста на возникновение мутаций остаст малоисследованными. В связи с этим важное значен приобретает разработка компьютерных методов для анализ особенностей полинуклеотидного контекста, влияющих к возникновение мутаций. Ниже дано описание разрабатываемой нам компьютерной системы для исследования роли этих особенностей. [c.90]

Рис. 5.4. Схема энзиматического метода секвенирования нуклеиновых кислот, основанного на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего цепь

Установленная секвенированием последовательность аминокислот может рассматриваться лишь в качестве одного из уровней структурной организации белка. Она закодирована в соответствующем гене и находится в тесной связи со вторичной и третичной структурами белка, его конформацией и биологической активностью. Образование вторичной и третичной структур [c.374]

Существует два принципиально различных подхода к определению нуклеотидной последовательности ДНК. Первый из них предложен А. Максамом и У. Гилбертом и основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. Последовательность операций при секвенировании ДНК методом Максама — [c.15]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Рис. 5. Расщепление рестриктазами крупного сегмента гена Р-цепи глобина кролика с образованием перекрывающихся фрагментов Секвенированне фрагмента 4, получаемого совместным действием рестриктаз Нае III К Нра 1. позволяет однозначно расположить друг относктельно Друга фрагменты I Н 2

Меченые фрагменты разделяют так же, как и при секвенировании ДНК по Максаму — Гилберту. [c.19]

Достигнута высокая точность распознавания структурных особенностей аминокислотных последовательностей белков, что позволяет считать эту технологию перспективной для решения задачи функциональной разметки аминокислотной последовательности. Это является особенно важным в связи с перспективой полного секвенирования генома человека и некоторых животных.Решение этой задачи потребует высокой точности распознавания, так как предстоит осуществить фукциональнус [c.259]

Большое число работ, опубликованных в 1980—1983 гг., посвящено отработке обратнофазовой гидрофобной хроматографии фенил-тиогидантоиновых производных аминокислот (ФТГ-АК). В виде таких производных аминокислоты одна за друго отщепляются при автоматическом определении последовательности аминокислот в полипептиде по методу Эдмана. Эта операция получила название секвенирования белков, а соответствующие автоматические приборы [c.196]

Модификацию Lys можно вести и с помощью ангидрида малеи-новой кислоты [Van Helden et aL, 1979]. В случае последующего автоматического секвенирования для модификации лучше пспользовать ангидрид более гидрофобной цитраконовой кислоты [Williams et al., 1980]. Блокирование разрыва по Arg можно осуществить обработкой белка 1,2-циклогександионом (используется редко). [c.298]

Двумерная и одномерная распределительная ТСХ на целлюлозных, силикагелевых и полиамидных иластинках аминокислот, их данзилированных, динитрофенильных и фенилтногидантоиновых производных (ФТГ-АК) последнее — как основной или контрольный метод идентификации аминокислот при секвенировании белков по методу Эдмана. [c.460]

Между двумя этапами, естественно, фигурирует перенос вещ ества с ацетилцеллюлозы на пластинку. Такое фракционирование используется в различных вариантах секвенирования нуклеиновых кислот, особенно богатых модифицированными (минорными) нуклеотидами (тРНК). [c.460]

Используя аналогичную систему ТСХ для идентификации ФТГ-АК в последовательных циклах секвенирования полипептидов по методу Эдмана (вручную), Рид и Мак-Кэй столкнулись со следующей трудностью иа месте ФТГ-Arg в каждом цикле выходил некий, также гасящий флюоресценцию фона побочный продукт реакции. Они описали метод детектирования истинного пятна ФТГ-Arg путем дополнительной обработки пластинки смесью (1 1) 0,02%-ного раствора фенантренхинона и 10%-ного раствора NaOH в 60%-ном этаноле. После такой обработки только пятна ФТГ-АК прн освещении длинноволновым УФ-светом давали интенсивную желто-зеленую флюоресценцию иа слегка флюоресцирующем голубоватом фоне пластинки [Reed, Ma Kay, 1978]. [c.485]

Фракционирование олигонуклеотидов в тонком слое играет центральную роль в некоторых методах секвенирования нуклепновых кислот, особенно тРНК, где из-за высокого уровня содержания модифицированных нуклеотидов методы секвенирования с использованием электрофореза в ПААГ наталкиваются на серьезные трудности. [c.496]

К описанным модификациям метода двумерного фракционирования олигонуклеотидов, ведущего свое происхождение от метода Сэнджера, мы снова вернемся в конце раздела при сопоставлении методов секвенирования тРНК, а сейчас остановимся на совершенно другом варианте двумерного фракционпрования олигонуклеотидов — с помощью ТСХ в обоих направлениях, т. е. без использования электрофореза. [c.500]

В настоящее время секвенирование тРНК в большинстве случаев осуществляют с помощью одного из двух рассмотренных ниже методов, включающих ТСЭ и ТСХ (выше отмечалось, что исполь. [c.502]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

Этап 1 протекает быстро в слегка щелочной среде. Этап II можно вести в кислой безводной среде, а гидрофобное производное (АТ-АК) легко перевести в такой органический растворитель, в котором укороченный пептид выпадет в осадок. Таким образом, АТ-АК и пептид можно отделить друг от друга. Иеред началом второго цикла секвенирования этот осадок должен быть снова растворен. Этап III протекает относительно медленно, так что его имеет смысл проводить отдельно, вне прибора, автоматически выполняющего последовательные циклы присоединения ФИТЦ к постепенно укорачивающимся остаткам полипептида и отщепления одной за другой АТ-ироизвод-ных аминокислот, которые выводятся наружу в коллектор фракций. Дополнительной обработкой водным раствором кислоты АТ-АК преобразуют в ФТГ-АК. [c.511]

Таким образом, в результате секвенирования получается ряд следующих друг за другом фракций, содержащих ФТГ-производные всей последовательности аминокислот в иолинеитиде. Встает задача пх идентификации. Эту задачу и решают (для каждой фракции отдельно) с помощью одного из хроматографических методов. [c.511]

Описанные реакции очень чувствительны к присутствию в среде кислорода, поэтому их приходится вести в атмосфере инертного газа. Кроме того, главное и особенно трудное требование состоит в совершенной полноте протекания реакции в каждом цикле. В нротивно.м случае, очевидно, от цикла к циклу будут накапливаться полипептиды, укороченные не должным образом, а производные аминокислот, которые должны были отщепиться в предыдущих циклах секвенирования, будут загрязнять продукты последующих циклов, создавая постепенно нарастающий уровень фона . Даже при 98%-ном выходе реакции в каждом цикле через 50—60 циклов фон становится настолько высоким, что дальнейшее секвенирование оказывается невозможным. [c.512]

ФИТЦ препаратом, дающим окрашенные производные отщепляемых, аминокислот [Wilson et al., 1979]. Здесь нет возможности останавливаться на этих и других интересных усовершенствованиях процесса секвенирования белков, поскольку это выведет нас за пределы круга вопросов, рассматриваемых в книге. Нам также придется вовсе оставить в стороне вариант секвенирования в твердой фазе (с закреплением полипептида с одного его конца на твердом носителе), а также интересное предложение о создании газо-жидкостного твердофазного секвенатора с миниатюрной неподвижной камерой, в которой полипептид задерживается на стекловолокнистом фильтре fHewi k et al., 1981]. [c.514]

Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 5.4). В этом случае обычно используют дидезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-З -ОН, представленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифицированный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК-полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида. Синтез in vitro молекулы ДНК в присутствии затравки (праймера) и небольшого количества одного из таких модифицированных нуклеотидов приводит к образованию фрагментов ДНК в виде лесенки . Если для получения таких фрагментов применять меченую ДНК (обычно проводят четыре реакции синтеза с использованием различных нуклеотидов, терминирующих цепь), а электрофоретический анализ проводить на четырех дорожках геля, то можно определить последовательность нуклеотидов. В настоящее время используют модифицированный метод, сводящийся к флуоресцентному анализу наборов фрагментов ДНК в процессе движения по одной дорожке геля. [c.109]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология