Реассоциация цепей ДНК

Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментированной ДНК, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15-98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть этих последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК. Примером таких уникальных последовательностей являются интроны, появление которых в геноме эукариот пока не нашло своего объяснения [6]. [c.24]

Рис. 17. Идеализированная кривая реассоциации цепей денатурированной ДНК (см. также рис. 107 и пояснения к нему к тексте)

Другой метод изучения гомологии, который можно назвать методом реассоциации в растворе, основан на связывании одноцепочечных нуклеиновых кислот в растворе, т. е. в данном случае, в отличие от мембранного метода, когда один из компонентов связан, оба компонента находятся в растворе. За реассоциацией цепей ДНК можно следить с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии или, в случае инкубации небольшого количества денатурированной ДНК с высокой удельной радиоактивностью в присутствии большого избытка немеченой денатурированной ДНК, с помощью измерения радиоактивности. В последнем случае способность меченых фрагментов образовывать двухцепочечные комплексы с немеченой ДНК количественно определяют по адсорбции на гидроксилапатите или по устойчивости к гидролизу нуклеазой 51. [c.130]

Начальная реассоциация цепей ДНК в растворе происходит по типу кинетики второго порядка [c.147]

Затруднения, связанные с реассоциацией цепей фрагмента, можно преодолеть, если приготовить одноцепочечные образцы ДНК путем разделения цепей в геле или синтезировать их в самой реакции ПЦР. Для разделения цепей фрагментов длиной не менее 500 п. н. могут быть с успехом использованы соответствующие агарозные гели, В случае более коротких фрагментов такой подход не эффективен. Однако недавно мы разработали метод, позволяющий синтезировать одноцепочечные ДНК в ходе реакции ПЦР (рис.З) [6]. [c.186]

Белки НЬ-А должны быть олигомерными. В отличие от иммуноглобулинов биологическая специфичность белка НЬ-А (рис. 4.2, б) определяется только двумя (идентичными) тяжелыми цепями легкие цепи всех белков НЬ-А в организме идентичны [86, 87]. Поэтому нет необходимости в ковалентной связи легких цепей с тяжелыми такая связь должна, быть только между тяжелыми цепями. Диссоциация и реассоциация легких цепей не могут нарушить молекулярной специфичности. Трехмерная структура белков НЬ-А была предсказана на основании данных по их специфичности и известной структуре иммуноглобулинов. Таким образом, физиологические данные способствуют появлению рабочих гипотез при исследовании структуры белка. [c.65]

Рестрикты (особенно — с липкими концами) могут быть сшиты с помощью ДНК-лигаз При необходимости липкие концы отжигают (отжиг—это специфическая реассоциация комплементарных цепей с образованием двухцепочечных молекул) [c.193]

ДНК/ДНК-гибридизация гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК разных видов. Как мы уже говорили, при нагревании изолированной ДНК две полинуклеотидные цепи расходятся в результате разрыва водородных связей. Такая денатурация (или плавление ), приводящая к образованию одиночных цепей, обратима при очень медленном охлаждении препарата будет происходить спаривание и реассоциация комплементарных участков. Если смешать короткие фрагменты денатурированных ДНК, полученных из двух различных, но близких между собой видов бактерий, при температуре выше точки их плавления и затем медленно охладить смесь, тоже будет происходить реассоциация. Двойные спирали, образовавшиеся из одиночных цепей ДНК двух разных организмов, называют гетеродуплексными молекулами. Для того чтобы в эксперименте можно было проследить за образованием гетеродуплексов, нужно, конечно, пометить ДНК одной из бактерий тяжелым или радиоактивным изотопом. [c.41]

РЕАССОЦИАЦИЯ ДНК. Взаимодействие комплементарных цепей с образованием двухцепочечной спирали. [c.525]

РЕНАТУРАЦИЯ. Реассоциация денатурированных комплементарных цепей ДНК с образованием двухцепочечной молекулы. [c.525]

Если комплементарные цепи нативной двухцепочечной ДНК разделить посредством нагревания или в щелочной среде, то при правильно выбранной температуре и концентрациях солей в растворе, они довольно легко снова образуют двойную спираль. Мы уже встречались с несколькими примерами такой реассоциации при обсуждении образования гетеродуплекса ДНК в главах 7 и 8. [c.261]

Реконструкцию структуры, состоящей из субъединиц, из отдельных субъединиц различных структур называют гибридизацией, Механизмом этого процесса может быть ренатурация или реассоциация. Например, если ДНК, у которой цепи содержат изотоп денатурирует и смешивается с одноцепочечной ДНК (денатурированной), меченной изотопом а затем подверга- [c.22]

Поведение ренатурировавшей неповторяющейся ДНК очень похоже на поведение исходного препарата ДНК до его денатурации. При проведении денатурации ренатури-ровавший препарат быстро плавится при Т л, значение которой чуть ниже значения Т л исходной нативной ДНК. Это означает, что реассоциация цепей прошла точно. Каждая уникальная последовательность сгибридизо-валась с полностью комплементарным ей участком. [c.228]

В оптимальных условиях при инкубации только одной меченой плазмидной ДНК реассоциация цепей этой ДНК друг с другом (самореассоциация) должна составлять менее 10%, в то время как в присутствии гомологичной ей немеченой ДНК реассоциировать должно более 85%. В каждом эксперименте измеряют также реассоциацию меченой плазмидной ДНК с ДНК не несущих плазмид бактериальных клеток и вычитают величину этой реассоциации (около 10% или меньше) из величин реассоциации, определенных для каждой реакции. [c.153]

Денатурируйте образец нагреванием (95 °С), затем быстро перенесите в спиртовую баню, охлажденную до температуры сухого льда, замедлив таким образом процесс реассоциации цепей. Добавьте секвенационный праймер и нагрейте до необходимой температуры отжига. [c.186]

Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего нас фрагмента ДНК Используя комплементарные к этим участкам олигомеры — праймеры, запускают амплификацию Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК, а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, отжига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера) Тепловая денатурация сопровождается расплетением двойной спирали ДНК При снижении температуры имеет место отжиг олигонуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных праймеров со своими комплементарными последовательностями Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой [c.204]

Если, например, вырастить культуру одной из бактерий на тяжелой воде (D2O), то у нее будет тяжелая ДНК, и тогда образование гетеродуплекса можно будет выявить путем центрифугирования в градиенте плотности s l-так же, как в опыте Меселсона и Сталя было доказано образование N/ N-rH6pHfl-ной ДНК. Можно, однако, пометить ДНК одного из партнеров, выращивая его на среде с С или с Если теперь смешать длинные отрезки денатурированной ДНК (из непомеченной С бактерии А) с короткими отрезками денатурированной ДНК (из помеченной С бактерии В), медленно охладить смесь и провести ее через фильтр, задерживающий длинные цепи, но пропускающий короткие, то на фильтре останутся молекулы гетеродуплекса. Оставшаяся на фильтре радиоактивность будет тем выше, чем больше радиоактивных отрезков (В) связалось с А-депями, т.е. она будет зависеть от того, идентичны ли (либо очень сходны) последовательности оснований ДНК А и В или же они совсем различны. Таким образом, реассоциация ДНК/ДНК дает возможность определять степень гомологии последовательностей ДНК разного происхождения. Контрольный опыт проводят с молекулами ДНК из одних и тех же бактерий (одну пробу метят, другую не метят) и произвольно принимают степень реассоциации за 100. Степень реассоциации молекул ДНК из различных штаммов выражают затем в процентах от этой величины. Рутинные методы определения гомологии между ДНК различных штаммов бактерий многократно видоизменялись, но все они основаны на том же принципе образования гетеродуплексов во всех случаях необходимо пометить одного из партнеров. [c.41]

Обнаружено, что ферменты, состоящие из нескольких субъединиц, значительно менее устойчивы в водно-органических смесях по сравнению с ферментами типа каталазы и пероксидазы, состоящими из одной полипептидной цепи. Необратимая инактивация ферментов, состоящих из нескольких субъединиц, вероятно, обусловлена неполной реассоциацией предварительно диссоциировавших субъединиц при возвращении системы к нормальным условиям. Процессы диссоциации и реассоциации субъединиц, происходящие под. влиянием органического растворителя. и гари замораживании, могут приводить к образованию полимерных форм, не обладающих ферментативной активностью. Так, замораживание растворов двух злектрофоретически индивидуальных форм лактат-дегидрогеназы, а затем их последующее плавление в присутствии хлорида натрия приводит к образованию пяти различных форм. Органические растворители, такие как этиленгликоль, пропилен-гликоль, глицерин или диметилсульфоксид, при их добавлении в растворы полностью ингибируют образование этих форм и, за исключением пропиленгликоля, способствуют сохранению ферментативной активности [626, 627]. Как правило, растворимость веществ, включая ферменты и субстраты, уменьшается при понижении температуры и при введении органических растворителей. Несмотря на это, для обнаружения промежуточных соединений при низких температурах часто бывает достаточно не очень больших концентраций субстратов, поскольку при понижении температуры увеличиваются стационарные концентрации [615, 628]. Необходимо, однако, проверять, являются ли обнаруженные при низких температурах промежуточные соединения теми же самыми, что и при нормальных условиях, так как направление процесса может измениться. Активность ферментов, которые находятся в биомем- ранах и связаны е липидами, падает при переводе их в водные буферные растворы. Например, известно, что цитохром Р-450 ин-активируется при экстракции в водные растворы (при этом наблю- [c.237]

Повторяющиеся последовательности и сателлитная ДНК — одна из закономерностей в чередовании нуклеотидов у большинства ДНК эукариотических клеток. Эти ДНК состоят из уникальных и частично повторяющихся последовательностей. Например, в ДНК мыши повторяющиеся последовательности составляют десятую долю всего генома и представлены приблизительно одним миллионом копий последовательности, содержащей около 30 пар нуклеотидов с более низким (Г + Ц)-содержанием по сравнению с остальной массой ДНК. Имея другую плавучую плотность, ДНК с повторяющимися последовательностями при центрифугировании в градиенте плотности s l образует отчетливую сателлитную полосу. Каждая из двух цепей этой ДНК настолько отличается по составу оснований, что они хорошо разделяются в растворе s I. Такие наблюдения основаны на исследованиях реассоциации двух цепей сателлитной ДНК, расчлененных ранее путем термической обработки. Реассоциация сателлитной ДНК осуществляется настолько быстро, что, по-видимому, в ней существует короткая последовательность, повторяющаяся много раз. [c.66]

Молекулы нативной и денатурированной ДНК связываются с гидроксиапатитом при низкой концентрации фосфата (0,01 — 0,03 М натрий-фосфатный буфер, pH 6—8). При 0,12—0,14 и 0,4—0,5 М концентрации указанного буфера элюируются соответственно одно- и двухцепочечные формы ДНК [101—104]. Присутствие других однозарядных анионов, по-видимому, не имеет значения, однако добавление в элюент мочевины и (или) детергентов, например додецилсульфата натрия, приводит к увеличению выхода высокомолекулярной ДНК. Концентрация ионов фосфата, при которой с колонки с гидроксиапатитом элюируются молекулы нативной или денатурированной ДНК, не зависит от температуры. Поэтому при фракционировании на таких колонках можно использовать как процессы денатурации ДНК (т. е. разделять комплементарные цепи ДНК, денатурированной непосредственно на колонке под действием температуры или денатурирующих агентов типа формамида), так и реассоциации ДНК (образования двойной спирали из отдельных цепей ДНК). Реассоциация главным образом зависит от концентрации комплементарных цепей и, следовательно, от частоты их повторов в рассматриваемой последовательности [105]. С помощью контролируемой реассоциации ДНК генома с оли-гонуклеотидными зондами (фрагментами РНК или ДНК) и последующего разделения полученных гибридов на колонках с гидроксиапатитом можно определить число повторяющихся или уникальных последовательностей этой ДНК [105]. [c.183]

Таким образом, длина уникальной ДНК. соответствующая oti/2 реассоциации, существенно меньше общей длины ДНК, соответствующей по химическому составу этой фракции. Иными словами, промежуточный компонент ведет себя так, как будто он включает последовательность длиной 6 -10 п. н., представленную 350 копиями на геном (поскольку 350-6-10 = 2,1-10 ). После денатурации одиночные цепи каждой из этих копий могут реассоциировать с комплементарными им цепями любой из 350 копий. Это значительно повышает концентрацию последовательностей, участвующих в реакции реассоциации, и объясняет, почему эта фракция ренатурирует при более низких значениях oti/2- [c.226]

Используя РНК в качестве зонда в эксперименте по реассоциации, можно определить, какие последовательности генома представлены в мРНК. Очень небольшое количество радиоактивной РНК (или ДНК) вносят в реакцию вместе с существенно большим количеством клеточной ДНК. Поскольку ДНК клетки присутствует в огромном избытке, ее часть, образовавшая гибриды с РНК-зондом, не изменит концентрации последовательностей одноцепочечной ДНК. Определяющим фактором реакции является реассоциация комплементарных цепей ДНК клетки (т.е. как будто РНК-зонд отсутствует). Такие реакции называют реакциями, определяемыми концентрацией ДНК. Реассоциацию всей ДНК определяют обычными способами (по изменению оптической плотности раствора или по связыванию с гидроксиапатитом). [c.231]

Реассоциацию фракции, ренатурирующей в нулевой момент времени, называют мономолекулярной реакцией, так как в реакции участвует только одна молекула ДНК. Это означает, что два реассоциирующих компонента должны располагаться в одной цепи ДНК. Поэтому такая реакция является внутримолекулярной реассоциацией последовательностей, противоположно ориентированных и расположенных близко друг к другу. Эти последовательности-обращенные повторы или палиндромы, уже рассмотренные нами в гл. 13. Такую фракцию иногда называют схлопнувшейся ДНК. [c.299]

САМОКОМПЛЕМЕНТАРНАЯ ДНК. Состоит из обращенных повторов, которые ренатурируют за счет реассоциации комплементарных последовательностей, расположенных на одной цепи в денатурированной ДНК. [c.526]

В 1985 г. был описан принципиально новый метод, позволяющий в миллион раз амплифицировать интересующие последовательности в препарате геномной ДНК,— полимеразная цепная реакция, ПЦР [21—23]. Идея метода и ее воплощение очень просты (рис. 6, А). Сначала синтезируются два дезоксиолиго-нуклеотида длиной 20—30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. Полярность выбрана так, чтобы после отжига их направления были обращены друг к другу. Избыточные количества этих олигонуклеотидов смешивают с геномной ДНК, и смесь нагревают для денатурации последней. Снижение температуры приводит к реассоциации олигонуклеотидов с гомологичными участками геномной ДНК. Затем проводят наращивание цепи при [c.138]

Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов. [c.185]

Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фрагментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-озид-5 -трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и ДНК полимеразы 1 Е. oli и используют для гибридизации. Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-ном формамиде при 62° в течение 18—24 ч ( мягкая ренатурация ), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит показателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двойные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Герхард и др,, 1984). [c.146]

Слишком много генов. Если у Е. соИ около 4500 генов и каждый ген кодирует свой белок, тогда не должно быть ни одного похожего гена, т. е. все гепы должны иметь различную последовательность нуклеотидов. Предположим, что мы взяли геном Е. oli, состоящий из 4,5-10 пар нуклеотидов и делим его приблизительно на 11000 фрагментов, содержащих около 400 пар нуклеотидов (меньше, чем размер среднего гена). Затем мы нагреваем эти фрагменты до 100°, и они разделяются на 22 000 одноцепочечных фрагментов, причем все они, согласно нашему предположению, должны быть разными. Теперь мы медленно охлаждаем их. Они сталкиваются случайным образом, и, если встречаются комплементарные цепи, происходит восстановление двухцепочечной спирали. Поскольку каждый фрагмент представлен единственной копией, то шансь на встречу с комплементарным партнером у всех одинаковы и процесс реассоциации должен происходить (и в действительности происходит) плавно и равномерно (рис. 15-1, слева). [c.264]

Проведем теперь тот же самый эксперимент с ДНК коровы. Ее геном (3-10 пар нуклеотидов) превратится в 7 500 000 двухцепочечных фрагментов ДНК, а после нагревания — в 15 ООО ООО одноцепочечных. Если каждый фрагмент представлен единственной копией, то кривая реассоциации должна быть похожа на кривую, которая получается в опыте с фрагментами ДНК Е. oli. Но это не так (рис. 15-1, справа). Значит, некоторые фрагменты присутствуют во мпогих копиях. Их комплементарные цепи встречаются очень часто, и ренатурация идет очень быстро. Другие фрагменты представлены меньшим числом копий, их реассоциация идет медленнее, чем в первой группе, но все еще достаточно быстро. Эти повторяющиеся фрагменты составляют приблизительно 40% всей ДНК коровы Оставшиеся 60% фрагментов, вероятно, уникальны, и их реассоциация идет со скоростью, сравнимой со скоростью реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ. [c.264]

Основной вопрос, возникающий при изучении третичной структуры, состоит в том, как ее рассматривать — как единое целое или как состоящую из отдельных доменов.Можно привести примеры обоих вариантов. В большинстве рассмотренных выше структур пептидная цепь пересекает структуру во всех направлениях много раз. Оша-ко в термолнзине (см. рис. 2.34) структуру можно разбить на две совершенно независимые области. Важно выяснить, могут ли эти отдельные области существовать в виде стабильных свернутых структур в отсутствие остальной части белка. Если это реально, то можно исследовать процесс их реассоциации н, следонательно, непосредственно получить некоторые сведения о специфических взаимодействиях и силах, участвующих в стабилизации третичной структуры. [c.106]

Разные типы распределения повторов. Некоторые тиш1чные кривые реассоциации показаны на рис. 9.36. Во всех трех случаях доля ДНК, связывающейся с гидроксилапатитом, возрастает с увеличением длины цепи, однако кривые существенно [c.198]

А. Денатурация (диссоциация) двухцепочечной ДНК при повышении температуры раствора и ренатурация (реассоциация) двух комплементарных цепей при охлаждении, Б. Кривые денатурации типичной двухцепочечной ДНК, получаемые при повышении температуры и pH. и рН - это значения температуры и pH соответственно, при которых ДНК денатурирована (или ренатурирова-на) наполовину. [c.47]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология