Рекомбинантные молекулы

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

Векторные молекулы. Трансформация. Ключевой операцией в генетической инженерии является введение в клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК. Это достигается при помощи так называемых векторных молекул, или векторов. Дело в том, что при обычном введении ДНК, например, в бактериальную клетку, она, как правило, подвергается атаке ферментов, которые гидролизуют ее на составные компоненты — нуклеотиды. В некоторых случаях ДНК выживает в клетке, однако в процессе деления клеток она не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки, она должна либо встроиться в ее геном (интегриройаться в хромосому) и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. [c.35]

В настоящее время разработаны методы рекомбинации генов в экспериментальных условиях, позволяющие получить новые комбинации генов, не существующие в природе. Синтез рекомбинантных молекул ДНК - новый инструмент в генетических исследованиях, получивших название генной инженерии. В рекомбинации участвуют различные ферменты рестриктазы, экзо- и эндонуклеазы, трансферазы, ДНК-лигазы. [c.61]

И все же первое место в современной биотехнологии принадлежит, конечно, генетической инженерии (технологии рекомбинантных молекул ДНК). Она предоставила исследователям новую, исключительно ценную возможность —изменять генетическую программу бактериальных, растительных и животных клеток, и тем самым как бы завершила формирование биотехнологии. Вероятно, поэтому само название биотехнология появилось после того, как возникла генетическая инженерия. [c.6]

Рис. 25.6. Добавление липких концов к фрагменту ДНК, имеющему тупые концы, перед встраиванием ДНК в вектор с целью создания рекомбинантной молекулы ДНК

Нобелевская премия за синтез первой рекомбинантной молекулы. [c.176]

Рис. 9.10. Образование рекомбинантных молекул ДНК. При действии одной рестриктазы на различные молекулы ДНК образуются фрагменты с комплементарными одноцепочечными концами. Соединение таких фрагментов в разных сочетаниях может приводить к образованию рекомбинантных молекул ДНК. Под действием ДНК-лигазы формирование рекомбинантных молекул завершается установлением ковалентных связей.

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями — палиндромами [c.26]

Отбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, по способности расти в присутствии антибиотика [c.38]

Засоление. Одним из лимитирующих факторов сельскохозяйственной продуктивности является засоление почв. Около 900 млн. га всех земель нашей планеты имеют повышенное содержание солей, а количество засоленных почв с каждым годом возрастает. Особую тревогу вызывает увеличение в почвах содержания солей, которое происходит в результате их искусственного орошения. Решение данной проблемы во многом зависит от разработки рациональных агротехнических приемов, правильной методологии орошения, использования для полива частично или полностью обессоленной воды. С развитием биотехнологии растений потенциально возможным является получение солевыносливых генотипов у важных сельскохозяйственных культур путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопластов или переноса генов при использовании техники рекомбинантных молекул ДНК. [c.145]

Наиболее распространенным методом генной инженерии является создание рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, бактериальных плазмид. Плазмиды — это кольцевые двухспиральные молекулы ДНК, содержащие несколько тысяч пар нуклеотидов. В исследованиях по генной инженерии обычно используют кишечную палочку Е. соИ. Получение рекомбинантных молекул ДНК включает ряд последовательных этапов [c.496]

Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструировании химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например, плазмиду или эписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации. Репликация такого репликона будет приводить к размножению также второго фрагмента, составляющего рекомбинантную молекулу. Исходный репликон становится при этом вектором для другого фрагмента ДНК. [c.276]

Рис. 9.13. Синтетические фрагменты ДНК, содержащие сайты рестрикции, можно использовать в качестве связующих звеньев (линкеров) при создании рекомбинантных молекул. А. Любой фрагмент ДНК без липких концов можно клонировать при использовании двухцепочечных линкеров. Б. Структура трех линкеров.

Важнейшим допущением в рамках модели, проиллюстрированной на рис. 14.1, является представление об образовании рекомбинантных молекул ДНК за счет разрыва и воссоединения цепей родительских молекул. Этот процесс происходит независимо от процесса полуконсервативной репликации ДНК. Консервативная природа рекомбинации была впервые выявлена при работе с фагом X. [c.134]

РИС. 15-31. Возможный механизм рекомбинации, включающий образование точечиых разрывов в произвольных местах гомологичных двойных цепей ДНК, расширение этих разрывов до незаполненных промежутков и ассоциацию комплементарных участков. Механизм миграции боковой цепи позволяет далее заполнить образовавшиеся промежутки н снова заправить все пропуски, в результате чего образуется рекомбинантная молекула ДНК. [c.283]

Из организма - донора нужных генов - экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мищень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция клонирующий вектор-встроенная ДНК ). [c.50]

ДНК включается в хромосому Е. соИ как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными генами (состояние лизогении). Однако при недостатке питательных веществ или иных неблагоприятных обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литический цикл развития. Размер ДНК фага X составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК рекомбинантного фага X, вставшего на литический путь развития. [c.72]

В некоторых случаях при гиперпродукции рекомбинантных белков образуются как растворимые, так и нерастворимые продукты, что усложняет процедуру очистки. Например, при экспрессии в клетках Е. соН гена инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) человека мол. массой 7,6 кДа примерно 90% рекомбинантных молекул локализуется в периплазме, а 10% секретируется. Чтобы вьщелить растворимую и нерастворимую формы IGF-I из периплазмы, для солюбилизации нерастворимой формы in situ добавляли мочевину и дитиотрейтол до высоких [c.367]

Прн работе с рекомбинантными молекулами ДНК возникает необходимость замены одного типа липких концов на другой. Для этой цели используются адапторные линкеры — частично двухцепочечные нуклеотиды, содержащие липкие концы, соответствующие двум разным рестрихтазам. Третий тип линкеров позволяет перейти от тупого конца ДНК к липкому, и их можно назвать дополняющими. [c.377]

В самом общем виде принцип генной иижеиерии изображен на рисунке 244. В какой-либо из заранее выделенных репликонов хозяина вводят in vilro нужный ген из другого источника. Полученную таким образом рекомбинантную молекулу, сохраняющую [c.426]

Специально сконструированы векторные плазмиды, позволяющие отличать клетки, содержащие рекомбинантные молекулы, от исходных бактериальных клеток. В качестве примера иа рисуи- [c.431]

Четвертый период в биотехнологии - генотехнический начался с 1972 года. В этот период, например, бьша, создана первая рекомбинантная молекула ДНК, был выделен лактозный ген из кишечной палочки, поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками. Для генотехнического периода характерны разработка интенсивных процессов (вместо экстенсивных), получение суперпродуцентов создание продуцентов разработка и внедрение экологически чистых технологий, автоматизация и компьютеризация биотехнологических процессов [5,22], [c.5]

Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от греч genesis — происхождение, возникновение, рождение) начался с 1972 г В этом году П Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК Однако следует отметить, что в 1969 г Дж Бекуит с коллегами выделил в химически чистом виде лактозный ien из кишечной палочки, показав тем самым возможность направленных манипуляций с генетическим материалом бактерий [c.17]

Генная инженерия возникла как результат всего развития науки о ДНК. Но событием, позволившим непосредственно приступить к перетасовке генов, было открытие ( зерментов рестриктаз. Рестриктазы узнают определенные, короткие последовательности нуклеотидов и разрезают молекулу ДНК в этом месте. Такие последовательности могут случайно встретиться в любой ДНК- Поэтому если подействовать какой-то рестриктазой на ДНК, скажем, мухи, а одновременно ею же на ДНК слона, то произойдет случайная перетасовка генов мухи и слона. Чтобы получились длинные гибридные, химерные или, как их еш,е называют, рекомбинантные молекулы, нужно лишь добавить фермент лигазу, сшиваюш,ий фрагменты ДНК друг с другом. Так в пробирке можно создать какие угодно комбинации генов, причем все они заведомо никогда не реализовались в живой природе из-за запрета на межвидовое скрещивание. [c.59]

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестрик-тазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантнук> молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазмиды pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечить, устойчивость. [c.317]

Одна-единственная фаговая частица, содержащая рекомбинантную молекулу ДНК, может менее чем за один день образовать более 10 идентичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки Е. соИ, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со временем образуя видимые колонии. При этом появляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтезируются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают миллиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейщее клонирование, нужно провести отбор трансформированных бактерий. [c.223]

Современная биотехнология как наука возникла в начале сороковых годов и получила ускоренное развитие с 1953 г., после эпохального открытия Джеймса Уотсона и Френсиса Крика о химической структуре и пространственной организации двойной спирали молекулы ДНК. Новое стратегическое ее направление — генетическая инженерия — родилось к 1972 г., когда в лаборатории Поля Бэрга впервые была синтезирована рекомбинантная молекула ДНК, что окончательно закрепило за биотехнологией и ее центральным звеном — биоинженерией (ядерной биологией) — важнейшее место в современной науке. [c.15]

Определение нуклеотидной последовательности — секвенирова-ние. Методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение. Но они также способствовали разработке исключительно эффективных новых методов секвенирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование позволяет доволь- [c.29]

Однако после такого спаривания целостность двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для их восстановления, т. е. сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Таким образом, лигаза завершает образование рекомбинантной молекулы ДНК. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 г. (П. Берг, США) и было показано, что использование рестриктазы, дающей липкие концы, в сочетании с ДНК-лигазой может послужить основой для создания общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК. В этой лаборатории впервые были соединены рекомбинантное ДНК вируса SV40 и бактериофага X с галактозным опе-роном Е oli. [c.34]

На рис. 14.1 показано, что образование рекомбинантных молекул ДНК за счет разрыва и воссоединения цепей сопровождается возникновением гетеродуплексного участка ДНК. Образование таких гетеродуплексов не обязательно связано с последующим разрезанием структуры Холлидея, которое приводит к рекомбинации фланкирующих генетических маркеров. Генетическим свидетельством образования гете-родуплексных молекул ДНК является факт существования гетерозиготных фагов X, которые при инфекции с множественностью 1 фаг на [c.134]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология