Денатурация нагреванием, фракционирование

Балластные белки обычно осаждают одним из известных методов фракционирования — избирательной денатурацией. Если фермент устойчив к нагреванию (например, рибонуклеаза выдерживает нагревание до 90° С без инактивации), проводят термическую денатурацию инертных белков, нагревая экстракт определенное время при 50—70° С. Применяют также кислотную денатурацию (подкисляют экстракт до pH 5 или ниже), если выделяемый фермент не инактивируется при данном pH используют и обработку экстракта хлороформом или смесью хлороформа и спирта. Денатурированные балластные белки отделяют от фермента центрифугированием или фильтрацией, а затем из водного раствора путем дробного осаждения (в основе которого лежит различная растворимость белков-ферментов) выделяют фракцию, обладающую наибольшей ферментативной активностью. [c.200]

В процессе выделения и фракционирования белков необходимо принимать известные меры предосторожности. Необходимо контролировать температуру, pH и концентрацию белка, а также ионную силу, концентрацию ионов тяжелых металлов (их удаляют с помощью ЭДТА) и значение окисли-тельно-восстановительного потенциала (оно поддерживается на низком уровне с помощью меркаптоэтанола или дитиотрейтола). Молекулы белков весьма неустойчивы. Инкубация белков даже при умеренной температуре, например при 37°, приводит, как правило, к их частичной денатурации. Большинство операций при очистке белка должно поэтому проводиться при температуре, близкой к точке замерзания используемого растворителя. Некоторые белки, однако, довольно устойчивы к нагреванию. Кратковременная тепловая обработка при выделении таких белков оказывается весьма полезной, так как дает возможность осадить большую часть загрязняющего материала. Весьма чувствительны белки также к сильно кислым и сильно щелочным значениям pH. Поэтому очистка белка должна проводиться в присутствии буферных растворов, обеспечивающих постоянство значения pH (в большинстве случаев значение pH должно быть близким к 7). Наконец, кон- [c.79]

Определены оптимальные условия ренатурации ДНК после ее тепловой денатурации I308]. Концентрация ионов патрия должна быть выше 0,4 М, а температура на 25 ниже температуры плавления. Так как переход спираль — клубок воспроизводим (в отношении физических свойств и тепловой инактивации биологических маркеров), при охлаждении образуется та же вторичная структура, а сколько-нибудь заметного образования неспецифических водородных связей не происходит. Полнота ренатурации увеличивается с увеличением молекулярного веса ДНК и, как и следовало ожидать, заметно зависит от гомогенности препарата. Степень реконструкции вторичной структуры убывает в последовательности для ДНК из бактериофага > мелких бактерий > бактерий > животных тканей, и этот порядок отражает изменение числа различных молекул ДНК и различие нуклеотидного состава, которыми характеризуется каждый из источников ДНК 1308]. Как было показано фракционированием ренатурированной трансформируюшей ДНК при иомош,и ультрацентрифугирования в градиенте плотности, ренатурация не относится к процессам типа все или ничего>л а образование двойной спирали вновь после разрушения может происходить в различной степени [309]. В основном это есть результат случайного расщепления ковалентных связей в полин клеотид-ной цепи при нагревании. При стандартных условиях тепловой денатурации и последующего охлаждения можно рассчитать, что в каждой цепи ДНК с молекулярным весом 10 может происходить в среднем по три разрыва. Поэтому в процессе ренатурации будут участвовать комплементарные цепи с длиной, различающейся на i/i—1/2, что понижает ренату рацию на 20—30% [310]. Действительно, на микрофотографиях часто наблюдаются клубки на одном или на обоих концах ренатурированных цепей, которые соответствуют выступающим концам однотяжных цепей. [c.605]

Так же как и в случае многих других эмпирических методов фракционирования, весьма маловероятно, чтобы исследователь, применяющий тепловую денатурацию белков, имел хоть какое-то представление о поведении многих, если не всех, белков, присутствующих в смеси, не говоря уж о таких подробных сведениях, которые даны на рис. 3.15. Однако о поведении определенного интересующего иследователя фермента можно судить, нагревая небольшие пробы при различных температурах с интервалами в 5°С. Время инкубации важно только для получения воспроизводимых результатов инкубация проб в течение 1 или 60 мин даст кривые одинаковой формы, но сдвинутые по оси температур. Тем не менее следует учитывать, что если инкубация в течение 1 мин очень удобна при работе с объемом 1 мл, то почти невозможно за такое короткое время нагреть и быстро охладить большой объем жидкости. Во время нагревания раствора до нужной температуры и последующего ее снижения происходит дальнейшая денатурация. [c.86]

Если раствор ДНК, денатурированной нагреванием, охлаждать, то вновь возникают слабые связи, и при определенных условиях могут получиться двуспиральные структуры, идентичные структурам исходного (до денатурации) препарата т. е. произойдет ренативация (отжиг ДНК). На явлениях денатурации и ренативации основс1н метод молекулярной гибридизации, который применяют для изучения строения нуклеиновых кислот, а также для их фракционирования. [c.112]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология