Ферменты центрифугированием

Для получения одноклеточной фракции суспензионной культуры иногда достаточно простого отстаивания в колбе в течение 15— 30 мин. При этом крупные агрегаты оседают на дно колбы, а надосадочная фракция содержит только одиночные клетки или мелкие агрегаты. В том случае, когда при отстаивании не удается получить одноклеточную фракцию, применяют мацерирующие ферменты, центрифугирование в градиенте сахарозы или фильтрование через сита (нейлоновые или металлические). [c.95]

Балластные белки обычно осаждают одним из известных методов фракционирования — избирательной денатурацией. Если фермент устойчив к нагреванию (например, рибонуклеаза выдерживает нагревание до 90° С без инактивации), проводят термическую денатурацию инертных белков, нагревая экстракт определенное время при 50—70° С. Применяют также кислотную денатурацию (подкисляют экстракт до pH 5 или ниже), если выделяемый фермент не инактивируется при данном pH используют и обработку экстракта хлороформом или смесью хлороформа и спирта. Денатурированные балластные белки отделяют от фермента центрифугированием или фильтрацией, а затем из водного раствора путем дробного осаждения (в основе которого лежит различная растворимость белков-ферментов) выделяют фракцию, обладающую наибольшей ферментативной активностью. [c.200]

Глюкоамилаза (10 мг фермента растворяют в 1,0 мл НгО, осадок удаляют центрифугированием). [c.25]

Образующиеся в процессе фракционирования осадки в большинстве случаев отделяют от маточного раствора на рефрижераторной центрифуге. Значения g, указываемые в предлагаемых методиках выделения ферментов, можно, как правило, снижать, соответственно увеличивая время центрифугирования (при фракционировании органическими растворителями этого делать не следует). Всегда нужно стремиться получать осадки максимальной плотности это увеличивает эффективность фракционирования, если выделяемый фермент находится в осадке, и повышает его общий выход, если он находится в маточном растворе. Получение плотного осадка после осаждения фермента органическими растворителями позволяет быстро понизить их концентрацию последующим добавлением небольшого объема воды или буферного раствора. [c.197]

При выделении фермента используют метод фракционирования белков путем изменения pH. Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение pH белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. Их вносят по каплям, по стенке сосуда, при постоянном перемешивании. После нейтрализации раствора проводят короткую инкубацию при 25—30° С, чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков. [c.199]

Осадки, образовавшиеся при фракционировании сульфатом аммония, не всегда легко отделяются центрифугированием, особенно при высокой концентрации соли в растворе. Иногда целесообразно использовать быстрофильтрующий складчатый фильтр. Некоторые ферменты достаточно быстро теряют активность в растворе сульфата аммония высокой концентрации. В этом случае для отделения осадка используют метод центрифугирования, как более быстрый. [c.200]

После добавления органического растворителя рекомендуется продолжать перемешивание еще 15—20 мин при температуре фракционирования. Образовавшиеся осадки отделяют центрифугированием при той же температуре. При более высокой температуре часть осадка может раствориться, а при более низкой часть белков из раствора может выпасть в осадок. Осадки обычно оседают легко, однако увеличение скорости центрифугирования даст возможность снизить его продолжительность. После центрифугирования осадок, содержащий фермент, необходимо растворить в воде или буфере, чтобы снизить концентрацию органического растворителя. Перед последующей обработкой для удаления органического растворителя проводят диализ или используют гель-фильтрацию. [c.203]

Для адсорбции белков достаточно перемешать раствор после добавления геля до получения однородной суспензии. После центрифугирования осадок отбрасывают, если ставилась задача адсорбировать балластные белки. Если адсорбирован фермент, осадок геля промывают несколько раз водой или слабым буферным раствором (если это не сопровождается потерей фермента). Для элюции фермента используют слабощелочной буферный раствор более высокой концентрации, чем тот, что использовался при промывании геля. Если фермент элюируется плохо, в буфер для увеличения элюции добавляют соль, [c.204]

Удаление сульфата аммония. Фракцию белка, насыщенную сульфатом аммония до 50%, вновь хроматографируют на колонке в тех же условиях, как описано выше. Первые порции элюата, собранные сразу после выхода свободного объема колонки, содержат фермент. Этот раствор выдерживают в течение 2,5 ч при О—4° С. Образующийся осадок собирают центрифугированием (18 000 об/мин, 30 мин). Супернатант отбрасывают (предварительно проверяют на ферментативную активность). [c.243]

Солюбилизация АТФ. Промытый осадок растворяют в 3 мл (в расчете на 400 г мышц, использованных для экстракции фермента) 10 мМ раствора АТФ, pH 7,2. Нерастворившийся белок отбрасывают центрифугированием при 11 500 в течение 10 мин. Супернатант, содержащий фосфофруктокиназу, разливают на несколько порций и хранят при —70° С. [c.243]

Активность иммобилизованных ферментов можно определить практически всеми известными методами (непрерывными и периодическими, спектрофотометрическими, рН-метрическим, флуоресцентными, химическими и др.). При работе с иммобилизованными ферментами не-> обходимо постоянно перемешивать реакционную смесь в процессе из--мерения активности, так как в противном случае по мере оседания частиц носителя активность будет уменьшаться. При определении активности ферментов методом отбора проб обычное осаждение белка (например, трихлоруксусной кислотой) в случае иммобилизованных препаратов можно заменить отделением фермента фильтрованием или центрифугированием. [c.298]

Из реакционной смеси отбирают аликвотную часть в несколько сот микролитров и быстро нагревают, чтобы дезактивировать фермент, убитые клетки отделяют центрифугированием и порцию над-осадочной жидкости вводят в хроматографическую колонку. [c.214]

Нерастворимые в воде ферменты получают путем их присоединения к нерастворимым полисахаридным носителям [65, 227, 249]. Применение нерастворимых ферментов упрощает проведение ферментативных реакций, так как такие ферменты могут быть легко удалены из реакционной смеси фильтрацией или центрифугированием, тогда как удаление растворенных ферментов — очень трудоемкая процедура. [c.275]

Концентрирование растворов ферментов достигают, избавляясь прежде всего от балластных белков. Если фермент термостабилен, например рибонуклеаза, то от белков освобождаются нагреванием раствора. Осадок отделяют центрифугированием. Иногда от белков освобождаются денатурируя их кислотами или воздействуя на ферментный раствор хлороформом или смесью хлороформа и спирта при низкой температуре. [c.202]

После частичного удаления балластных белков для последующего концентрирования ферментов используют фракционирование растворами солей, например, сульфата аммония. В этом случае надо найти такую концентрацию солей, при которой неактивные белки коагулируют, а активный фермент остается в растворе. Осадок отделяют центрифугированием и после лиофилизации надосадочной жидкости получают ферментный препарат. [c.202]

Другой метод препаративного синтеза АТР разработан недавно Уайтсадсом используется ацетилфосфат в качестве донора фосфатной группы н иммобилизованный фермент (разд. 4.7) в качестве катализатора [30]. Реакция проходит в мягких условиях (при pH, близких к нейтральной среде, и комнатной температуре) относительные (к субстрату) количества нерастворимого полимерного катализатора незначительны катализатор легко удаляется (центрифугированием), а реакция проходит более специфично, чем при неэнзиматическом синтезе (наиример, аденозинтетрафосфат в качестве побочного продукта не образуется). Суммарная реакция сводится к следующему [c.138]

М триэтиламмоний-бикарбонатном буфере до конечной концентрации 1—5 мг/мл и добавляют раствор карбоксипептидазы (отношение фермент субстрат= 1 30—1 200). Проводят инкубацию при 37°С и отбирают аликвоты, содержащие 0,1—0,2 мкмоль белка, сразу после добавления фермента (нулевая точка), а затем через 30, 60, 120 и 420 мин после начала инкубации. Параллельно с опытной ставят контрольную пробу без белка, но содержащую все остальные компоненты реакционной смеси, включая карбоксипептидазу. Реакцию останавливают добавлением к отобранным пробам раствора уксусной кислоты до конечной концентрации 10%. Если при этом выпадает осадок, его отделяют центрифугированием и промывают 2 раза водой. Супернатант после первого центрифугирования и промывные жидкости объединяюг и упаривают на роторном испарителе. [c.156]

Кристаллизация. Раствор белка охлаждают (можно использовать охлаждающую смесь Na l со льдом). К охлажденному до 0° С раствору добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 до конечной концентрации, соответственно равной 0,001 и 0,01 М. Кристаллизация фосфорилазы b начинается через 15—20 мин (иногда через 1—2 ч). Для более полной кристаллизации раствор фермента оставляют на ночь при О—4° С. На следующий день суспензию центрифугируют (15000 , 5—20 мин лри О—4° С), осадок растворяют в 30 мМ Na-p-глицерофосфате, pH 6,8, содержащем 30 мМ L-цистеин (или 2-меркаптоэтанол) при 30° С. Нерастворившийся белок отделяют центрифугированием и отбрасывают. К супернатанту вновь добавляют АМФ и Mg (СНзСООН) 2 в той же концентрации. [c.222]

Кристаллизация. После аффинной элюции можно провести кристаллизацию фермента. Элюат, содержащий глюкозофосфатизомеразу, диализуют в течение ночи против насыщенного сульфата аммония, приготовленного на 25 мМ триэтаноламине, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1%-ный 2-меркаптоэтанол, pH 8,2. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в том же буфере разводят до концентрации белка 10 мг/мл. К раствору белка медленно на холоду добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до 48%-ного насыщения. Выпавший при этом аморфный осадок удаляют. Раствор белка оставляют а ночь при комнатной температуре для кристаллизации. [c.237]

Фракционирование сульфатом аммония. Объединенный супернатант помещают в сосуд с тающим льдом и при постоянном перемешивании добавляют сульфат аммония до 38%-ного насыщения (21,3 г на 100 мл). Продолжают перемешивание еще 30 мин, после чего центрифугируют 20 мин при ЮОООё. Осадок отбрасывают. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 55%-ного насыщения (10,1 г на 100мл). Осадок, содержащий фермент, собирают центрифугированием и растворяют в небольшом объеме 50 мМ Ма-р-глицерофосфатного буфера (pH 7,2), содержащего 2 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ и сульфат аммония при 38°/о-ном насыщении. Проводят диализ против того же буфера. [c.242]

Перекристаллизация. Кристаллическую суспензию фосфофруктокиназы центрифугируют. Кристаллы растворяют в Ыа-р-глицерофос-фате —ЭДТА—АТФ, pH 7,2. Нерастворившийся осадок отбрасывают после центрифугирования, а супернатант используют для повторной кристаллизации. Кристаллы фосфофруктокиназы собирают центрифугированием, суспендируют в небольшом объеме Ыа-р-глицерофосфатного буфера, pH 7,2, содержащего 2 мМ ЭДТА, 2 мМ АТФ и сульфат аммония при 40%-ном насыщении. В этом растворе фермент хранят при 4° С. [c.242]

Фракционирование сульфатом аммония. К полученному экстракту, (рН 7,0) добавляют при постоянном перемешивании небольшими порциями мелкоизмельченный сульфат аммония (50,5 г на 100 мл раствора). Доводят pH до 7,0—7,5 добавлением концентрированного аммиака. Через 30 мин выпавший осадок удаляют центрифугированием (60 мин при 30 ОООg). Доводят pH раствора до 7,8—8,0 и оставляют на ночь. Кристаллизация начинается сразу и продолжается в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием (60 мин при 30 000g ) и суспендируют в растворе сульфата аммония насыщения 0,5, содержащем 5 мМ ЭДТА и 10 мМ дитиотреитол. Дальнейшая очистка фермента может проводиться следующими методами. [c.255]

Тепловая обработка. Около 1/4 всего количества осадка растворяют в 0,05 М триэтаноламиновом буфере, pH 7,6, содержащем 2,0 М сульфат аммония и 1 мМ дитиотреитол, до достижения концентрации белка 40 мг/мл и инкубируют в водяной бане при 50°С в течение 5 мин Затем быстро охлаждают в ледяной бане и денатурировавшие белки удаляют центрифугированием при 15 000 в течение 40 мин. Белок из раствора осаждают добавлением сульфата аммония до 3,2 М концентрации, центрифугируют (40 мин при 15 000 ) и осадок растворяют в 10 мМ ЭДТА, содержащем 1 мМ дитиотреитол (pH 7,6). Проводят диализ против того же раствора. После диализа концентрация белка должна составлять 50—60 мг/мл. Этот раствор используют для дальнейшей очистки фермента. [c.262]

Фракции, содержащие 3-фосфоглицераткиназу, объединяют и добавляют сухой сульфат аммония, доводя раствор до помутнения. Фермент кристаллизуется в течение нескольких дней. Кристаллы отделяют центрифугированием и растворяют их в небольшом объеме буфера 30 мМ имидазол, содержащий 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, pH 7,0. Медленным добавлением сухого сульфата аммония доводят раствор до помутнения. Кристаллы хранят в виде суспензии в насыщенном растворе сульфата аммония, содержащем 30 мМ имидазол, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотреитол, pH 7,0. [c.264]

Хроматография на КМ-целлюлозе. К раствору белка добавляют раствор протаминсульфата (1 г/50 мл воды), доведенный трисом до pH 7,0. Полученный осадок удаляют центрифугированием. Затем к супернатанту добавляют 0,01 объема 1 М раствора триса и понижают pH до 6,0 с помощью 1 М какодиловой кислоты. Разводят рйствор до 800 мл добавлением 10 мМ триса, содержащего 1 мМ ЭДТА (pH 6,0, доведено какодиловой кислотой), и наносят его на колонку (4,5x30см) с КМ-целлюлозой, уравновешенную 10 мМ трисом, 1 мМ ЭДТА, доведенным до pH 6,0 какодиловой кислотой. После нанесения белка на колонку начинают элюцию линейным градиентом КС1. Для создания градиента используют два сосуда, один из которых содержит 1 л буфера, а другой — 1 л буфера, приготовленного на 0,2 М КС1. Скорость тока — 120 мл/ч. Фракции, содержащие более 300 единиц активности фермента в 1 мл, объединяют. [c.266]

Кристаллизация. Фракции, содержащие активность фермента, объединяют и добавляют к ним медленно, при перемешивании, 600 г/л сульфата аммония. После 30-минутного стояния осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 20 мМ калий-фосфатном буфере, pH 6,5 до достижения концентрации белка 20—30 мг/мл. К раствору медленно добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до помутнения. Крисгаллизация проходит при комнатной температуре и заканчивается через несколько дней. [c.266]

Перекристаллизация. Суспензию центрифугируют (20 мин при 12 000 ). Кристаллический осадок растворяют в 1 мМ ЭДТА, содержащем 0,2 мМ ДТТ. Нерастворившийся осадок отбрасывают, к раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55. Это вызывает кристаллизацию фермента. Через несколько дней кристаллы отделяют центрифугированием, взбалтывают в небольшом объеме полунасыщен-ного раствора сульфата аммония и хранят в виде суспензии на холоде. [c.274]

Осаждение креатинкиназы спиртом. Выпавший за ночь небольшой осадок удаляют центрифугированием при 1000 g в течение 30 мин. Из прозрачного центрифугата осаждают креатинкиназу, доводя концентрацию этанола до 70 o6.%i тщательно следя за тем, чтобы температура смеси не поднималась выше О—2° С. Осадок фермента собирают центрифугированием при 2000 g в течение 20 мин, растворяют в небольшом объеме 0,01 М глицин-NaOH буфера, pH 9,0 (или в 0,05 М трис-НС1 буфере, pH 8,0). [c.295]

Диализ. Раствор фермента диализуют лротив 0,01 М глицин-NaOH буфера, pH 9,0, в течение 48 ч с 4-кратной сменой буфера. Небольшой осадок, образовавшийся в мешочке для диализа, удаляют центрифугированием при 1000 g. Прозрачный центрифугат препарата фермента разливают ио небольшим порциям, замораживают и хранят при [c.295]

Навеску (5 г) тканевой кашицы (приготовление см. на с. 65) взвешивают и переносят в стеклянный стакан гомогенизатора Поттера. Добавляют среду выделения из расчета 9 мл среды на 1 г ткани и гомогенизируют в течение 30 с с помощью тефлонового пестика без нарезки. Полученный гомогенат центрифугируют при 20 ООО в течение 15 мин. Супернатант после центрифугирования представляет собой 10%-ную растворимую клеточную фракцию. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при —5°С в течение 2 нед. Размораживание растворимой клеточной фракции проводят при комнатной температуре. Перед определением активности аспартатаминотрансферазы препарат фермента разводят средой выделения до конечного разведения 1 100. [c.352]

При дозах детергента 0,3 и 0,5 мг на 1 мг белка митохондрий действие дигитонина исследуют также в присутствии 1 М КС1. В случае адсорбции фермента на внутренней мембране митохондрий под действием КС1 возможна эффективная солюбилизация аспартатаминотрансферазы. Это можно установить, определив активность фермента в супернатанте после центрифугирования обработанной суспензии при 20 000g в течение 20 мин. [c.353]

К полученному элюату добавляют дитиотреитол до конечной кон центрации 1 мМ и сухой сульфат аммония до 50%-ного конечного на сыщения. После 20-минутного перемешивания осадок белка отделяют центрифугированием при 12 000 g в течение 10 мин и растворяет в небольшом объеме 50 мМ трис-НС1 буфера, pH 7,8, содержащего 1 мМ дитиотреитол. Препарат фермента можно хранить в виде сульфатам-монийного осадка при О °С в течение нескольких дней. [c.375]

Адсорбция гексокиназы на фосфолипидных мембранах (липосомах). Адсорбцию (иммобилизацию) гексокиназы на липосомах проводят суспендированием препарата липосом (3 мг лецитина) в 1 мЛ раствора фермента, содержащего различные количества единиц используемого фермента, а также 15 мМ МдСЬ или 5 мМ глюкозу в качестве адсорбирующих реагентов. Контрольная проба адсорбирующих реагентов не содержит. После 30-минутной инкубации при 0° С мембраны, содержащие адсорбированную гексокиназу, отделяют центрифугированием при 100 ООО я в течение 1 ч и суспендируюг в среде инкубации. Препарат иммобилизованной гексокиназы используют для изучения свойств в день получения. [c.376]

Очистка препарата тяжелого меромиозина осаждением сернокислым аммонием. Наиболее простым способом очистки служит высаливание фермента сернокислым аммонием. При этом собирают фракцию, выпадающую между 40—60% насыщения Следует, однако, соблюдать два условия во-первых, использовать сернокислый аммоний, перекристаллизованный с ЭДТА, так как даже следовые количества ионов магния, прочно связываясь с ТММ, ингибируют активность, и, во-вторых, перед добавлением к раствору фермента раствора насыщенного сернокислого аммония необходимо проконтролировать pH последнего и в случае необходимости довести его до нейтрального или слабощелочного. Выпавший в осадок тяжелый меромиозин отделяют центрифугированием, растворяют в небольшом объеме (3—6 мл) бидистиллята и диализуют при О—4 °С в течение ночи против 1 л бидистиллированной воды, чтобы освободиться от сернокислого аммония. Внешний раствор несколько раз меняют и проводят контроль на присутствие в нем ионов 5042- с помощью насыщенного раствора хлористого бария. В диализном мешочке может вновь выпасть осадок, который следует отцентрифугировать и отбросить. В надосадочной жидкости одним из общепринятых методов определяют содержание белка, которое обычно составляет 1—10 мг/мл. [c.395]

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей (рис. 4.26). Для этого сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре О—4°С. Обычно распределение ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изолированных при дробном центрифугировании гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая осаждается при средней скорости центрифугирования, во фракции микросом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из нее удается изолировать частицы, известные как лизосомы, размер которьгх занимает промежуточное место между размерами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция также является гетерогенной, поскольку состоит в основном из элементов эндоплазматической сети неоднородного строения. [c.158]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология