Балластные белки рис

Рис. 159. Схема очистки рекомбинантного интерферо-Е1а с помощью моноклональных антител (МкАТ) 1 - диализат с интерфероном и другими бактериальными белками, 2 - интерферон, 3 - балластные белки, 4 - МкАТ, 5 -интерферон, связывавший с МкАТ, 6 - слабая кислота.

Температура денатурации разных белков неодинакова. Используя даже сравнительно мягкие условия нагревания, можно добиться коагуляции значительной части балластных белков без существенной инактивации выделяемого фермента. [c.199]

Вещества, имеющие большую поверхность частиц (гель фосфата кальция и гель гидроокиси алюминия), характеризуются высокой адсорбционной способностью. Разные белки адсорбируются и элюируются по-разному, что и дает возможность использовать адсорбенты для очистки ферментов. Различают негативную адсорбцию, когда при добавлении адсорбента фермент остается в растворе, и положительную адсорбцию, когда фермент адсорбируется, а часть балластных белков остается в растворе. Наибольший эффект достигается при их совместном использовании, т. е. сначала адсорбируют возможное ко- [c.203]

Адсорбционные свойства свежеприготовленных алюминиевого и кальций-фосфатного гелей изменяются при хранении. Поэтому в литературе встречаются рекомендации использовать для работы постаревшие (в течение нескольких недель или месяцев) гели. Однако каждый раз требуемое количество геля, необходимое для адсорбции фермента или балластных белков, приходится подбирать экспериментально. Обычно оно не соответствует количествам, использованным Б предыдущем выделении или указанным в методике. [c.204]

Необходимое количество геля подбирают следующим образом. В несколько пробирок наливают одинаковое количество ферментного раствора (минимальный объем) и добавляют разные количества геля. Перемешивают до получения однородной суспензии, центрифугируют и в центрифуге определяют ферментативную активность. То соотношение геля к ферментному раствору, при котором в надосадочной жидкости остается примерно 90% первоначальной активности при адсорбции балластных белков и около 10% при адсорбции исследуемого фермента, считается оптимальным. На основании полученного соотношения рассчитывают количество геля, которое необходимо добавить на весь объем ферментного раствора. [c.204]

Для адсорбции белков достаточно перемешать раствор после добавления геля до получения однородной суспензии. После центрифугирования осадок отбрасывают, если ставилась задача адсорбировать балластные белки. Если адсорбирован фермент, осадок геля промывают несколько раз водой или слабым буферным раствором (если это не сопровождается потерей фермента). Для элюции фермента используют слабощелочной буферный раствор более высокой концентрации, чем тот, что использовался при промывании геля. Если фермент элюируется плохо, в буфер для увеличения элюции добавляют соль, [c.204]

Концентрирование растворов ферментов достигают, избавляясь прежде всего от балластных белков. Если фермент термостабилен, например рибонуклеаза, то от белков освобождаются нагреванием раствора. Осадок отделяют центрифугированием. Иногда от белков освобождаются денатурируя их кислотами или воздействуя на ферментный раствор хлороформом или смесью хлороформа и спирта при низкой температуре. [c.202]

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении). [c.26]

После частичного удаления балластных белков для последующего концентрирования ферментов используют фракционирование растворами солей, например, сульфата аммония. В этом случае надо найти такую концентрацию солей, при которой неактивные белки коагулируют, а активный фермент остается в растворе. Осадок отделяют центрифугированием и после лиофилизации надосадочной жидкости получают ферментный препарат. [c.202]

По этим же причинам чувствительность метода снижается при большой концентрации белков, обладающих буферными свойствами. В связи с этим метод потенциометрического титрования при постоянном значении pH в большей мере удобен для работы с очищенными препаратами холинэстераз, лишенными балластных белков. Впрочем, при высокой чувствительности рН-метра удается достаточно точно определять активность холинэстераз даже в гомогенатах тканей. Так, используя рН-метр ЛП-1 с чувствительностью —0,005 ед. pH, нам удавалось измерять скорости реакции порядка 0,01 мкмоля ацетилхолина в 1 мин. при работе с гомогенатами нервной ткани различных животных. [c.150]

Избирательную адсорбцию ферментов проводят двумя основными способами. Если фермент адсорбируется, то его тем самым извлекают из смеси, а затем элюируют. При этом балластные белки в растворе остаются в подобных случаях говорят о положительной адсорбции. Возможно и обратное — фермент не адсорбируется, а действие адсорбента состоит в том, что он убирает из раствора неактивные, загрязняющие фермент белки, которые способны связываться с ним. Тем самым ферментный белок очищается. Это случай негативной (отрицательной) адсорбции. При любом варианте необходимо тщательно соблюдать условия pH, температуры и ионной силы. Если в растворах ферментов содержатся — часто это бывает после солевого фракционирования — значительные количества минеральных солей, то они мещают адсорбции и их лучше удалить либо диализом, либо пропустив раствор через сефадекс. Кроме того, для лучшего связывания фермента желательно, чтобы концентрация его в растворе была невелика (не более 0,5—1,0%), количество адсорбента было большим, по весу в 15—20 раз превышающим количество ферментного белка, а pH среды был слабокислым. [c.149]

Дальнейшие способы концентрирования полученных ферментных вытяжек и очистки их от сопутствующих веществ, например балластных белков, солей, примесей других ферментов, также весьма разнообразны. [c.126]

Следующий этап очистки — удаление балластных белков и других загрязняющих веществ главным образом смещением pH среды и фракционной денатурацией нагреванием. Небелковые примеси (липидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот) удаляются многими специфическими методами. [c.142]

Очень часто бывает удобным в качестве первой (подготовительной) ступени очистки изменить реакцию среды таким образом, чтобы часть балластных белков подверглась кислотной денатурации, стала нерастворимой и выпала в осадок. При работе, например с экстрактами животных тканей, до начала основной очистки pH доводят до 5,0 затем, после выдерживания на холоде несколько минут, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Таким способом из экстракта удаляется большое количество нуклеопротеидов и нерастворимых частиц полученный раствор прозрачен, а фермент в нем в значительной мере очищен. Опасностью при этом является частичная (или даже полная) денатурация выделяемого белка и его выпадение в осадок. Смещение pH в щелочную сторону для подобных целей не практикуется, так как большинство денатурированных белков, оставаясь в растворе, в щелочной среде не выпадает. [c.142]

Ионы металлов редко применяют как единственный способ очистки, а чаще в сочетании с другими методами, такими как фракционирование при помощи солей или спиртов. Иногда тяжелые металлы используют для осаждения балластных белков из ферментного препарата это можно делать только тогда, когда доказано специфическое сродство металла к определенным реакционноспособным группам некоторых типов белковых молекул. Благодаря такой специфичности металлы, подобранные соответствующим образом, можно использовать также для улучшения кристаллизации ферментов из смеси или для их дробного осаждения. [c.148]

Балластные белки обычно осаждают одним из известных методов фракционирования — избирательной денатурацией. Если фермент устойчив к нагреванию (например, рибонуклеаза выдерживает нагревание до 90° С без инактивации), проводят термическую денатурацию инертных белков, нагревая экстракт определенное время при 50—70° С. Применяют также кислотную денатурацию (подкисляют экстракт до pH 5 или ниже), если выделяемый фермент не инактивируется при данном pH используют и обработку экстракта хлороформом или смесью хлороформа и спирта. Денатурированные балластные белки отделяют от фермента центрифугированием или фильтрацией, а затем из водного раствора путем дробного осаждения (в основе которого лежит различная растворимость белков-ферментов) выделяют фракцию, обладающую наибольшей ферментативной активностью. [c.200]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Автолизат почти не содержит балластных белков, которые расщепляются в процессе автолиза. Это обусловливает ряд технологических преимуществ. Автолизат как бы самоочищается, причем самоочистка выражается в двух моментах растворимые белки ткани расщепляются пепсином, а нерастворимые компоненты (жиры и др.) сами отделяются на поверхности возникающего прозрачного раствора. [c.206]

Методы получения и очистки. Сырьем для получепия Ф. является биологич. материал — органы животных, растения, микроорганизмы. Для промышленного получения Ф. используются гл. оор. микробы и грибки, содержание Ф. в к-рых может быть искусственно повышено селекцией и созданием специальных мутантов. Получение Ф. складывается из след, основных стадий а) экстракция Ф. из материала (обычно солевыми, буферными р-рами) б) грубое фракционирование белков экстракта с освобождением от балластных белков и др. веществ в) фракционирование обогащенных р-ров Ф. методами хроматографии на ионитах, препаративного электрофореза. Прп необходимости проводится кристаллизация и перекристаллизация Ф. [c.207]

Для удаления большой массы неактивных белков, находящихся в растворе, используют методы избирательной денатурации посредством прогревания экстрактов при 50—70° С в течение определенного времени. Проводят также денатурацию белков путем подкисления раствора фермента до pH 5,0 или ниже и выдерживания его при охлаждении в течение 10—15 мин. Иногда . рименяют осаждение балластных белков тем или иным реактивом. Выпавший осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием. [c.127]

Рис. 16.12. Влияние балластных белков и сил Лондона на реакцию агглютинации.

Рассмотренный только что для обычной сефарозы, этот вариант элюции, естественно, находит применение и при использовании гидрофобизированной агарозы. В качестве примера процитируем недавно опубликованную работу по мягкой очистке HMG-белка из ядер печени на колонке со-аминобутилагарозы. Этот белок растворим в растворе сульфата аммония вплоть до концентрации, достигающей 70% от насыщения. Сначала такой концентрацией СА в нейтральном 0,01 М трис-буфере высаливали из экстракта ядер большое количество балластного белка. Затем надосадочную жидкость, содержащую около 40 мг белка, вносили на колонку размером 2 X X 30 см, уравновешенную тем же раствором СА. Элюцию вели снижающимся линейным градиентом концентрации СА в том же буфере (500 мл) со скоростью 20 мл/ч, т. е. примерно 7 мл/см -ч. Низкая скорость элюции характерна для всех опытов такого рода ввиду повышенной вязкости концентрированных солевых растворов и соответствующего снижения скорости диффузии макромолекул. Около 30% белка не садилось на колонку и удалялось при первоначальной промывке. В ходе элюции выходило четыре пика, в первом из которых методом электрофореза идентифицировали HMG-белок [ onner. omings, 1981]. [c.181]

ПРОНАЗА КОМПЛЕКС, частично очищенная от балластных белков смесь протеолитических ферментов, продуцируемых штаммом Streptomy es griseus К-1 содержит эндопептидазы, аминопептидазы и карбоксипептидазы. Осн. компоненты П.к.-сериновые протеиназы А-Е (содержат в активном центре остаток серина). Ферменты П. к. стабилизируются добавлением Са " . Мол, массы компонентов П.к. 16-27 тыс. для протеиназ А, В, D, Е установлена первичная структура, а для А и В-пространств, строение. [c.101]

В последующих примерах очистки мы не будем приводить профили элюции, так как все они выглядят примерно одинаково пик той или иной акт1 вности очищаемого белка на фоне широкого профиля распределенных по всему объему элюцпи балластных белков. Сосредоточим свое внимание на выборе условий хроматографии. [c.303]

Этот выбор диктуется в основном стремлением сохранить нативность очищаемого белка и максимально уменьшить неспецифическую сорбцию других компонентов исходной смеси. Само аффинное связывание вещества с лигандом, как правило, от состава буфера я ид-кой фазы зависит мало. Интересами сохранения нативности и растворимости белка диктуются выбор pH, наличие соли, а иногда (например, для белков мебран) введение в буфер добавок органических растворителей или детергентов. Все это определяется известными свойствами данного белка. Неспецифическая сорбция примесей, в частности балластных белков, на матрице и спейсерах происходит за счет тех же самых сил (притяжения разноименно заряженных групп, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), которые обусловливают и биоспецифическое снизывание вещества с лигандом. Избирательность и прочность аффинной связи обусловлены кооперативным действием различных сил в области связывания, где они дополняют друг друга. Благодаря такой кооперации имеется возможность ввести в буфер факторы, ослабляющие действие сил какого-либо типа или даже всех их одновременно, но в такой степени, что биоспецифическое аффинное взаимодействие будет ослаблено лишь частично, в то время как неспецифическую сорбцию удастся подавить практически полностью. [c.404]

В технологических процессах медицинской промышленности особое значение имеет, например, возможность избавляться от балластных белков ферментативным расщеплением их. Такой способ применяется в производстве лечебных сывороток и вакцин, для их очистки и концентрации. Ферментативное расщепление балластных белков может быть также использовано при выработке антибиотиков, гормонов, некоторых витаминных препаратов, в будущем — нуклеиновых кислот. Расщепляющее действие ферментов (главным образом протеолитических) необходимо при выработке лечебных гидролизатов белков, некоторых специальных продуктов лечебного питания, аминокислот или их смесей. Оно необходимо и при выработке разнобразных бактериологических сред, используемых для медицинской диагностики, для производства токсинов и анатоксинов, иногда антибиотиков и иных лекарственных средств. Подобное техническое использование ферментов имеет хорошие перспективы в ферментной промышленности. [c.323]

Очистка экстракта этанолом и тепловая денатурация балластных белков. Измерив объем фильтрата, помещают его в охлаждающую смесь (лед — Na l), добавляют при постоянном перемешивании сухой NH4 I до конечной концентрации 0,1 М, затем доводят pH экстракта до 9,0, осторожно приливая 5 М NH4OH. Перемешивают 30 мин, добавляют 1,5 объема охлажденного до —10° С — (—20° С) этилового спирта. Спирт добавляют медленно, по каплям из делительной воронки, перемешивая экстракт и следя за тем, чтобы температура смеси не повышалась выше О—2° С. Затем температуру смеси постепенно доводят на водяной бане до 20° С. Оставляют при этой температуре на [c.295]

М. Ц. диссоциирует на субъединицы прп обработке его восьмпмолярным р-ром мочевпны лпбо при диализе против ацетатного буфера pH 4,0, содержащего аскорбиновую или этилепдпаминтетрауксус-ную к-ту. Выделение Ц. производят фракционированием белков сывороткп крови сульфатом аммония, осаждением спиртом в изоэлектрич. состоянии балластных белков, избирательной денатурацией белков хлороформом II спиртом и последующей экстракцией Ц. пз конечного осадка солевым р-ром (см. также Металлопротеиды). [c.411]

Препараты сефарозы с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой, иммобилизованной при разной степени активации, помещают в колонки (размер 0,5x3 см) и уравновешивают 0,15 М раствором Na I. Затем при комнатной температуре через колонки пропускают антисыворотку до полного насыщения иммуносорбента антителами (т. е. до прекращения адсорбции антител на сорбенте при пропускании дополнительных порций антисыворотки). Иммуносорбент отмывают от балластных белков 0,15 М раствором Na l до исчезновения поглощения при длине волны 280 нм в элюате. [c.304]

Б. Очистка аргиназы от балластных белков тепловой обра б о т к о й. Гомогенат наряду с исследуемым ферментом содержит большое количество других белков и ферментов ткани. Температура денатурации разных белков различна. Можно вызвать денатурацию значительного количества сопутствующих белков с помощью нагревания при 60 °С. Стабильность аргиназы к нагреванию в этих условиях выше по сравнению с другими, белками. [c.49]

При получении ферментного белка его легче извлечь из цитоплазмы, где он находится в растворимом состоянии, но весьма важно уметь выделять его из структурных образований клетки (ядра, оболочки, митохондрии, микросомы и др.), в которых он бывает более или менее прочно фиксирован. Предварительное отделение структурных элементов облегчает получение растворимых ферментных белков, находящихся в цитоплазме. Чтобы извлечь структурно-связанные ферменты, нужно либо получить из клеток их комплексы (с балластными веществами) и затем разрушить, либо разрушить комплекс в клетке с тем, чтобы в растворе иметь только сами ферменты. Обычно ферменты освобождаются из комплексов химическим воздействием, как обработкой бутанолом, растворами детергентов, как например, холата и дезоксихолата, натрийдоцедилсульфата, твина, эмазола и др. Весьма эффективно применять для этой цели гидролитические ферменты, как например, липазы, нуклеазы или протеолитические. В последнем случае надо иметь в виду, что выделяемый из комплекса ферментный белок может быть частично или полностью расщеплен вместе с балластными белками, от которых стремятся избавиться. [c.141]

Иногда на ранних стадиях очистки можно использовать и другие способы. Так можно удалить большую часть балластных белков, осторожно прибавляя в экстракт соль тяжелого металла, например свинца. Эта операция требует осторожности, потому что большое количество свинца приведет к потере значительной части фермента. Можно использовать хлороформ, так как известно, что встряхивание растворов белков со спиртово-хлорофор-менной смесью вызывает денатурацию. [c.143]

Из множества способов измельчения сырья в промышленном производстве ферментных препаратов применение нашл различные способы механического разрушения тканей и клеток (с помощью мясорубок, куттеров, гомогенизаторов, растиранием). Кроме того, используют действие органических растворителей, автолиз, например дрожжей, реже — замораживание и оттаивание. Действие ультразвука или вводимых извне ферментов— лизоцима, целлюлаз и т. п.—применяется мало. Удаление балластных белков кратковременным прогреванием или изменением pH среды используется во многих производствах. Можно отметить, что эти операции, легко проводимые в лабораторных условиях, становятся довольно опасными в производстве, когда они выполняются с большими количествами веществ и в связи с этим замедляются. Здесь необходим тщательный контроль стабильности (денатурации и инактивирования) основного выделяемого белка. Это соображение, впрочем, относится практичес ки ко всем операциям препаративной химии ферментов. [c.156]

Таким образом, в результате хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе удаляется основная масса балластных белков и пигментов. Удельная активность препарата повышается в 10—50 раз при выходе лецитиназы от 30 до 74%. [c.219]

Антитоксические сыворотки подвергают очистке и концентрации методом Диаферм-3 СССР , включающим стадии ферментативного гидролиза и осаждения сульфатом аммония. В результате такой обработки удаляются балластные белки и уменьшается величина молекулы антитоксического глобулина, что обусловливает снижение анафилактоген-ных свойств. Кроме того, в очищенных сыворотках содержится большее количество антитоксина в единице объема по сравнению с исходными сыворотками. [c.619]

Очищенный и адсорбированный столбнячный анатоксин — жидкий препарат, представляющий собой беловатую или слегка желтоватую гомогенную суспензию. Основным действующим началом препарата является очищенный от балластных белков токсин столбнячной палочки, обезвреженный формалином и сорбированный на гидроокиси алюминия. В качестве консерванта препарат может содержать 0,01% мертиолата или 0,25% фенола. [c.575]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология