Гибридизация in situ

МИ, проводят гибридизацию in situ с комплементарными им зондами, и если обнаруживается, что эти последовательности встречаются в геноме один раз, то синтезируют пару комплементарных им праймеров и проводят амплификацию СА-повтора. Далее, используя эту пару праймеров, проводят ПЦР-тестирование ДНК, полученной от большого числа индивидуумов. ПЦР-продукты, длина которых для удобства электрофоретического разделения выбирается примерно 200 п. н., разделяют в полиакриламидном геле. Если длина амплифицированного таким образом сегмента ДНК одинакова для всех образцов ДНК, значит, повтор не полиморфен (рис. 20.14, А), и наоборот, если образуются [c.455]

Хромосомную локализацию гена-мишени определяют методом гибридизации in situ с кДНК-клоном или выбранным с его помощью геномным клоном. Для более точной локализации [c.468]

Привязка индивидуальных транскриптов (клонов кДНК или экспрессированных последовательностей-мишеней) к хромосомным районам с помошью метода флуоресцентной гибридизации in situ, ПЦР и т.д. [c.561]

Где располагаются блоки сателлитной ДНК Развитие техники гибридизации нуклеиновых кислот позволило определить расположение последовательностей сателлитной ДНК непосредственно в хромосоме. При гибридизации in situ или цитологической гибридизации хромосомную ДНК денатурируют, обрабатывая клетки, распластанные на покровном стекле. Затем к препарату добавляют радиоактивный ДНК- или РНК-зонд. Зонд гибридизуется с комплементарными ему участками денатурированного генома. Расположение участков гибридизации можно определить с помощью радиоавтографии. [c.301]

Рис. 28.16. Под большим увеличением показана гибридизация in situ на дисках 87А и 87С с меченой РНК, выделенной из клеток после теплового шока.

Рис. 28.15. Индивидуальные диски, содержащие определенные гены, можно идентифицировать методом гибридизации in situ.

В опытах по трансфекции массу добавленной к реципиентным клеткам ДНК обычно увеличивают за счет избытка ДНК-носителя, препарата какой-то другой ДНК (например, ДНК спермы лосося). Доказано, что трансфицируемые клетки получают ДНК-носитель в виде последовательностей, фланкирующих селектируемые с каждой стороны. Следовательно, трансфекция осуществляется структурой ДНК, состоящей из ряда сцепленных последовательностей всех типов, присутствующих в препарате донора. Поскольку ревертанты по селектируемому маркеру утрачивают весь этот материал, кажется вероятным, что трансфицируемые клетки приобретают только одну такую структуру ДНК. Данная структурная единица может образовываться благодаря конкатемерному сцеплению донорных последовательностей в ходе реакции, которая проходит очень быстро по сравнению с другими событиями, вовлекаемыми в процесс трансфекции. Такая трансфицируемая единица может иметь протяженность около 1-10 п.н. Мы не можем установить с помощью метода гибридизации, сцеплена ли донорная единица с хромосомной ДНК реципиента (интересующие нас концевые фрагменты представлены в слишком незначительных количествах). Вероятно, что первая стадия процесса заключается в образования нестабильных внехромосомных единиц, которые впоследствии стабилизируются в результате интеграции. В некоторых клеточных линиях методом гибридизации in situ было показано, что трансфицированные клетки содержат донорный материал, интегрированный в хромосомы хозяина. Любая определенная клеточная линия имеет только один сайт интеграции однако сайты в каждой линии различны. Вероятно, выбор сайта для интеграции - случайное событие иногда оно связано с большими хромосомными перестройками. [c.500]

ГИБРИДИЗАЦИЯ С КОЛОНИЯМИ, Метод гибридизации in situ, используемый для выявления бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, которые несут фрагменты ДНК, гомологичные определенным последовательностям, [c.520]

ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU. Реакция гибридизации между денатурированной ДНК клеток, раздавленных на предметном стекле микроскопа и меченной радиоактивными изотопами одноцепочечной РНК или ДНК гибридизация обнаруживается благодаря последующей радиоавтографии, [c.520]

Часто при гибридизации к меченому зонду добавляют большой избыток (тысячекратный) немеченой конкурирующей ДНК (табл. 18.5). Этот прием уменьшает неспецифическое связывание зонда. В рассматриваемом примере в отсутствие конкурирующей ДНК (второй ряд табл. 18.5) в большей части клеток гибридизация с фрагментом 14,9 т.п.н. происходит в области 1р36, однако значительная часть черных точек на автографе, означающих гибридизацию, оказывается распределена и по многим другим хромосомным локусам. В этом случае могут выявляться последовательности человеческой ДНК, гибридизуюгциеся с зондом менее специфично. В таблице 18,6 приведены гены человека, картированные с помощью гибридизации in situ. [c.315]

Таблица 18.6. Гены человека, картированные с помощью гибридизации in situ

ДНК-зонды, содержащие последовательности искомых генов, дают возможность идентифицировать эти гены, даже если они и не экспрессируются. Это можно сделать с помощью таких методов, как гибридизация в растворе (достаточно устаревший подход), гибридизация по Саузерну и гибридизация in situ. [c.291]

Для локализации специфических последовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и клетках используют гибридизацию in situ [47] [c.242]

Нри клоиироваиии геиов самой трудной задачей является распознавание в библиотеке тех редких колоний, которые содержат интересующий нас фрагмент ДНК Это особенно справедливо в отиошеиии геномной библиотеки, так как здесь, для того чтобы выделить нужный ген млекопитающего, приходится среди миллиона клеток разыскивать какую-нибудь одну Чаще всего для этой цели пользуются особой формой гибридизации in situ, основанной на высокой специфичности [c.331]

Анализ политенных хромосом свидетельствует о том, что в интерфазном ядре каждая хромосома расположена отдельно, т.е разные хромосомы не сильно перевиты друг с другом (рис. 9-98) Более того, установлено, что в интерфазном ядре и другие типы хромосом, а не только политенные, стремятся занять дискретные домены Папример, методом гибридизации in situ с соответствующими ДПК-зондами можно выявить отдельную хромосому в гибридных млекопитающих, растущих в культуре (рис. 9-99). Замечено, что большая часть ДПК такой хромосомы занимает очень небольшую часть интерфазного ядра. Этот факт свидетельствует о том, что каждая отдельная хромосома остается компактной и структурированной, благодаря чему отдельные ее части могут активно участвовать в синтезе РПК. [c.168]

В этой главе рассматриваются методы синтеза и использования в экспериментальных целях РНК, полученной in vitro с помощью РНК-полимераз фагов SP6, Т7 и ТЗ. Основное внимание мы уделили использованию радиоактивных РНК-зондов для рутинного анализа нуклеиновых кислот и не пытались изложить, кроме как в самых общих чертах, более специальные аспекты их применения, например для гибридизации in situ, в качестве смысловой мРНК или трансляционных матриц. По таким вопросам мы постарались дать ссылки на ключевые работы, которые позволят хорошо разобраться в технических возможностях этих методов. [c.12]

Радиоактивные молекулы РНК все шире используются в качестве зондов в гибридизации in situ для выявления специфических мРНК и определения их локализации в срезах тканей. Эти методы впервые были описаны сотрудниками лаборатории Анджерера, и для детального ознакомления с ними мы отсылаем читателей к работам [19, 20]. [c.35]

Важным контролем, необходимым при гибридизации in situ, служит гибридизация с зондом, который заведомо не будет взаимодействовать ни с одной нз РНК препарата. Это исклю- [c.35]

Оценить эффективность амплификации генов можно либо с помощью гибридизационных методов, позволяющих детектировать увеличение количества копий специфических последовательностей ДНК или мРНК, либо с помощью количественного анализа экспрессии белка. Наиболее информативно сравнение данных по всем трем контрольным параметрам (количества ДНК, РНК и белка), так как изменения этих параметров не всегда коррелируют друг с другом. Кроме того, полезную информацию может дать локализация амплифицированных последовательностей на метафазиых хромосомах с помощью гибридизации in situ например для оценки стабильности экспрессирующих клонов при культивировании в неселективных условиях. [c.262]

Дайте капле высохнуть и рассмотрите хромосомы в фазово-контрастном микроскопе. Препараты готовы теперь для гибридизации in situ хранить их следует при комнатной температуре, предохраняя от пыли. На этом этапе можно выявить хромосомы типа double minute. [c.268]

Современная генетика Т.3 (1988) -- [ c.313 , c.314 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.242 , c.331 ]

Новое в клонировании ДНК Методы (1989) -- [ c.35 , c.268 , c.270 ]

Генетика человека Т.3 (1990) -- [ c.118 , c.128 ]

Культура животных клеток Методы (1989) -- [ c.304 , c.309 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.165 , c.213 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.242 , c.331 ]

Биохимия Т.3 Изд.2 (1985) -- [ c.140 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология