Метод бляшек покрытия

В 60-х годах были достигнуты важные успехи, открывшие новые пути изучения В-клеток. Первым из ннх была разработка метода локального гемолиза, который позволил идентифицировать и подсчитывать индивидуальные В-клетки, вырабатывающие антитела к определенному антигену. В простейшем варианте этого метода берут лимфоциты (обычно из селезенки) у животного, иммунизированного бараньими эритроцитами (БЭ). Их помещают затем в агар вместе с избытком Ю. В результате на чашке получается газон из иммобилизованных БЭ с вкраплением лимфоцитов. В этих условиях клетки не могут передвигаться, но любые выделяемые В-клеткой антитела будут диффундировать и покрывать поверхность всех БЭ, находящихся поблизости. Такие покрытые антителами эритроциты можно лизировать, добавив комплемент (разд. 17.5). Таким образом, присутствие каждой выделяющей антитела клетки обнаруживается по прозрачному пятну ( бляшке ) в темном слое БЭ. Аналогичный метод можно использовать для подсчета клеток, вырабатывающих антитела к другим антигенам, таким как белки или полисахариды, если присоединить эти антигены к поверхности бараньих эритроцитов. [c.20]

Проводят скрининг полученных изолятов вируса на способность давать бляшки при 31 и 39 °С. Для этого зараженные чашки инкубируют параллельно при каждой температуре. Альтернативный метод состоит в прямом скрининге бляшек, образованных вирусом, обработанным мутагеном. Для этого 2 чашки с культурой, покрытой слоем 0,9%-ного агара толщиной 2 мм, делят на секторы и в каждый сектор помещают 1 бляшку., После адсорбции в течение 30 мин при 31 °С заливают второй слой агарового покрытия (5 мл на чашку). После этого одну чашку инкубируют при 31 °С, а другую при 39°С. Из секторов, где бляшки образуются при 31 °С, но не при 39 °С, их извлекают для дополнительной проверки. [c.158]

Если нет возможности подсчитать бляшки сразу же после -окрашивания, следует иметь в виду, что они остаются видимыми по крайней мере в течение 48 ч, причем их размер не увеличивается при помещении в герметически закрытый контейнер в атмосфере 5%-ного СОг при 4°С. Если необходимо получить более стабильный препарат, применяют альтернативный метод окрашивания. В этом случае агаровое покрытие удаляют и фиксируют клеточный монослой буфером с формальдегидом [10% 38%-НОГО формальдегида (объем на объем) в РВ5] 2—3 мин. Затем клетки окрашивают 10 мин, добавляя в каждую чашку несколько миллилитров толуидинового синего (1%-ный водный раствор). После окрашивания краситель отмывают водой и чашки высушивают. Данный метод окрашивания применим и в том случае, если покрытие готовят на основе КМЦ. [c.180]

Время бляшкообразования под бентонитовым покрытием для различных вирусов неодинаково. Результаты образования бляшек для энтеровирусов, например, учитывают через 36 — 48 ч. Культуральные сосуды переворачивают монослоем вверх, смывая средой дегенерировавшие клетки. Бляшки, образуемые различными типами энтеровирусов, отличаются по величине, интенсивности развития и характеру краев. Поскольку одна вирусная инфекционная частица (вирион) образует одну бляшку, метод бляшкообразования позволяет точно определить количество инфекцио чных единиц в материале, а также измерить нейтрализующую активность вирусных антител. [c.268]

Более точным количественным методом учета от-дега>ных вирусных частиц является метод бляшек (рис. 33). Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое клеточной культуры. Каждая бляшка образуется при размножении одной вирусной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим методом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появ- [c.59]

Описаны различные модификации метода бляшек с использованием суспензии клеток в агарозе или агарового покрытия [16, 18]. Один из этих методов разработан для медленно размножающегося вируса бешенства [19]. Сублиния клеток ЗНК-21 (клон 13S) была адаптирована к росту в суспензионной культуре в присутствии агарозы в течение 1,5—2 нед [20] (эти клетки способны расти как в монослое, так и в суспензионной культуре на среде МЕМ-10). Клетки, хранящиеся в жидком азоте, сначала выращивают в виде монослоя, а затем пассируют путем регулярной трипсинизации. Размороженные клетки проходят около 30 пассажей. После этого их способность давать бляшки может нарушиться. [c.118]

Число инфекционных вирионов определяют методом бляшек. Реовирус формирует бляшки на разнообразных клеточных культурах, но чаще всего для титрования используют Ь-клетки или обезьяньи клетки СУ-1. Вирусные бляшки под 1%-ным агаровым покрытием при 37°С образуются на 4—5 сут их выявляют прижизненным окрашиванием нейтральным красным или 0,01%-ным раствором кристаллического фиолетового после фиксации формалином и удаления агарового покрытия. Обычно при культивировании реовируса описанными выше методами отношение числа физических частиц к числу БОЕ составляет 20—50 1 заметное увеличение этого отношения свидетельствует об образовании ДИЧ, что сопровождается снижением выхода инфекционных вирионов. Как уже отмечалось, реовирус исключительно эффективно размножается в мышиных Ь-клетках, и в принципе можно получить 25 мг очищенного вируса из 1 л зараженной суспензионной культуры. На практике для штаммов первого (например, Ленг) и третьего (например, Диринг) серотипов выход составляет 3—10 мг/л, а для штаммов второго серотипа (например, Джонс) —2—5 мг/л. [c.207]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология