Глюкозооксидаза восстановление активности

Для регенерации окисленных ферментов используют также модифицированные электроды с адсорбированными редокс-полимерами, содержащими п- и о-хинонные группы (рис. 15.2) [12-14]. Такие электроды эффективно окисляют восстановленные глюкозооксидазу, L-лактатоксидазу и ксантиноксидазу в диапазоне потенциалов от 0,05 до 0,5 В (относительно Ag/Ag l) при pH 7. Установлено [12-14], что эти ферменты окисляются при потенциале окисления полимерного модификатора, и, таким образом, последний действует как медиатор. Основной недостаток этих редокс-полимерных электродов заключается в том, что они довольно быстро (обычно за 5 дней) теряют каталитическую активность [12, 14]. Позже был описан [3] амперометрический глюкозный сенсор на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной на графите, который предварительно обработали N-метилфеназинием (NMP). Авторы нашли, что функция электрода к глюкозе строго линейна в диапазоне 0,5-150 мкМ, но использовать его можно вплоть до концентрации 2 мМ. Иммобилизованная глюкозооксидаза стабильна в течение нескольких месяцев, однако медиатор следует обновлять ежедневно. [c.216]

В других окислительных коферментах имеются иные, чем изоаллоксазиновая, восстанавливающиеся группы. Простейший опыт, свидетельствующий о том, что ФАД является специфическим коферментом глюко-зооксидазы, заключается в следующем если бы отщеплением кофермента от фермента можно было получить нативный неактивный белок, то возвращение активности при добавлении к этому белку ФАД говорило бы о специфичности этого кофермента. Но стандартный метод непригоден в данном случае, так как белковая часть глюкозооксидазы денатурируется нри всех операциях, в которых отщепляется кофермент. Установлено, что ФАД является простетической группой другого фермента — оксидазы /)-аминокислот, в которой неактивный белок может быть выделен в нативном состоянии. При кипячении с водой белковая часть глюкозооксидазы денатурируется и освобождается кофермент. Добавление полученного раствора к раствору нативного белка оксидазы Д-аминокислот приводит к восстановлению активности этого фермента, что является доказательством того, что ФАД — простетическая группа для обоих ферментов. [c.710]

Известно несколько путей, позволяющих осуществить эффективное заселение активных центров ферментов электронами (или электронными вакансиями). Первый путь предполагает использование низкомолекуляриых диффузионно подвижных переносчиков электронов (медиаторов), способных акцептировать электроны с электрода и отдавать их активному центру фермента. Этот механизм используется в большом числе ферментативных электродных систем, в частности, в реакциях с участием гидрогеназ — биологических катализаторов активации молекулярного водорода. (В системе гидрогеназа — метилвио-логен — угольный электрод удается электрохимически окислять водород без перенапряжения в условиях, близких к равновесным.) Второй путь заключается в непосредственном электрохимическом окислении — восстановлении активных центров ферментов, прямом переносе электронов (вакансий) с активного центра фермента на электрод (или обратно). Механизм прямого переноса электронов по пути электрод — активный центр фермента уже реализован в реакции электрохимического восстановления кислорода до воды с участием медьсодержащей окси-дазы, в реакции электровосстановления водорода с помощью гидрогеназы. Третий путь состоит в использовании ферментов, включенных в матрицу органического полупроводника. Для этого применяют полимеры с системой сопряженных связей, обладающие длинной цепью сопряжения, или полимеры с комплексами переноса заряда. С помощью ферментов, иммобилизованных в органические полупроводники, удалось осуществить ряд интересных электрохимических реакций, в частности электрохимическое окисление глюкозы с участием глюкозооксидазы. [c.69]

Рис. 7-2. Восстановление активной глюкозооксидазы из ДНФ—АпоГО и FAD. Растворы (10 мкл), приготовленные на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 6,5, и содержащие FAD в разных концентрациях (25— 500 нМ), смешивали с 10 мкл раствора ДНФ—АпоГО и инкубировали 30 мин при 25 С. К каждому из полученных растворов добавляли смесь для определения активности (4 мл), инкубировали при 25 °С еще 5 мин и измеряли поглощение при 590 нм. Смесь для определения активности, приготовленная на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 6,5, содержала 75 мМ D-глюкозу, 3 мМ ДМАБК,

Рис. 7-4. Подавление восстановления активной глюкозооксидазы из ДНФ— АпоГО и FAD аитисывороткой к ДНФ. К 50 мкл ДНФ—АпоГО (25 нМ относительно FAD-связывающих участков) прибавляли различные количества антисыворотки против ДНФ. Объемы растворов доводили до 200 мкл с помощью 0,1 М натрий-фосфатного буфера, pH 6,5, и инкубировали 30 мин при 25 С. Добавляли 100 мкл 10 мкМ FAD, инкубировали еще 30 уин при 25 и измеряли активность глюкозооксидазы (см. подпись к рис. 7-2).

Ферменты, принимаюшие участие в окислении или восстановлении биологических молекул (оксидоредуктазы), либо содержат в активном центре группу, которая может окисляться/восстанавливаться, например железо, медь, флавин или хинон, либо выполняют свою биологическую роль совместно с каким-либо редокс-кофактором, например ЫАВ(Р) . Из-за трудности осуществления прямой электрохимической реакции между редокс-центром и голым электродом и отсутствия эффективных электро-каталитических поверхностей для рециклирования восстанавливаемого кофактора в первых ферментных электродах электрохимические процессы лишь косвенно влияли на активность фермента. Классическим примером является сенсор глюкозы па основе фермента глюкозооксидазы и полярографического кислородного электрода, предложенный Кларком и Лайонсом [15] в 1962 г. и усовершенствованный Апдайком и Хикссом [54] в 1967 г. (гл. 1). Глюкозооксидаза представляет собой РАВ-содержащий фермент (рис. 15.1), катализирующий окисление глюкозы в глюконовую кислоту [c.212]

Электровосстановление пероксида водорода на электродах из NMA T NQ , содержащих адсорбированную пероксидазу, начинается при 0,3-0.5 В. Используя метод вращающегося диска, авторы установили, что этот процесс лимитируется каталитической активностью фермента. Для данной системы /с = 80 мкМ и max = 0,27 мА см . Рассчитанная константа скорости гетерогенной реакции составляет 8,5-10 см с . Эти электроды в сочетании с глюкозооксидазой используют также для конструирования биферментных сенсоров, чувствительных к глюкозе. Принцип работы таких сенсоров - биоэлектрокаталитическое восстановление пероксида водорода, образуемого под действием глюкозооксидазы. [c.222]

Swoboda [17], исследуя апофермент глюкозооксидазы, отметил, что при отщеплении ФАД значительная часть апофермента (80%) имеет пониженную константу седиментации (равную 4,5 S против 8,0 S для нативного фермента), хотя молекулярный вес остается постоянным (153 000). При этом значительно изменяется стабильность белка к действию проназы и тепловой инактивации. Очевидно, при отщеплении ФАД происходят значительные изменения в структуре апофермента. При добавлении ФАД все эти изменения исчезают и полностью восстанавливается как исходная структура, так и активность фермента. Следует отметить, что частичное восстановление исходной структуры идет и тогда, когда вместо ФАД к апоферменту добавляется АДФ, хотя ферментативная активность при этом, конечно, не восстанавливается [28]. Это свидетельствует о важной роли адениловой части ФАД в образовании его комплексов с белками. Исследуя кинетику восстановления [c.160]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология