Биосенсоры на основе ферментов

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов [c.101]

Если холинэстераза иммобилизована с помощью ковалентного связывания, то срок службы биосенсора возрастает Так, датчик, состоящий из рН-электрода с иммобилизованной на поверхности ацетилхолинэсте-разой (путем сшивки глутаровым альдегидом с альбумином), функционирует без изменения характеристик достаточно длительное время. С его помощью определяли паратион и севин на уровне 10 - 10моль/л Продолжигельность анализа 30 мин. Содержание паратиона и севина контролировали по относительному снижению отклика сенсора после внесения в ячейку аликвоты пробы. Заметим, что величина измеиения pH зависит не только от активности фермента, но и от буферной емкости раствора. Поскольку увеличение кислотности происходит лишь на мембране, а в объеме раствора pH остается практически постоянным, обычно применяют высокие (до 0,1 моль/л) концентрации субстрата и ячейки большого (100 мл и выше) объема. Кроме глутарового альдегида для иммобилизации холинэстеразы используют сополимеры акрил- и метакриламида, желатин. В последнем случае стеклянный шарик рН-электрода погружают в 5-10%-й раствор желатина, содержащий фермент, затем высушивают и обрабатывают водным раствором глутарового альдегида. Аналогичные мембраны используют и в датчиках на основе рН-чув-ствительных полевых транзисторов (911. [c.294]

Так, на основе кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы, и электрода Кларка разработан биосенсор на аскорбиновую кислоту. Активность фермента в природной матрице достаточна для проведения 50-80 определений аскорбиновой кислоты. Биосенсор на основе кожуры кабачка и кислородного электрода позволяет определять аскорбиновую кислоту во фруктовых соках. В табл. 14.2 приведены примеры биосенсоров на основе растительных материалов. [c.504]

При разработке биосенсоров, особенно на основе катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, имеет смысл использовать электрод как своего рода кофактор. Примером может служить хорошо изученная система, содержа- [c.142]

Описаны многочисленные конструкции потенциометрических и амперометрических холинэстеразных биосенсоров [84 . В частности, интерес представляст потенциометрическая система на основе двух платиновых электродов. Измеряемой величиной является потенциал одного из элекфодов, который служит анодом В ячейку вносят раствор бутирил-тиохолиниодида (0,002 моль/л) с pH 7,4. При введении в раствор аликвоты пробы, содержащей холинэстеразу, потенциал анода понижается, причем скорость его изменения АЕ/А1 зависит от природы фермента и концентрации фосфорорганических веществ (систокс, паратион, зарин и др.) в растворе. Пределы обнаружения составляют для зарина - 0,0002, систокса - 0,01 и паратиона - 0,18 мкг/мл. Погрешность определений - [c.293]

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помогают вьшолнять десятки быстрых и точных анализов при диагностике заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (инсектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитических задач в химической и микробиологической промышленности, а также в научных исследованиях. [c.102]

С помощью рекомбинантной техники можно улучшить биологические компоненты биосенсоров на основе ферментов и цельных клеток. При этом не только улучшатся аналитические характеристики биосенсоров, например путем оптимизации входящих в них ферментов, но и расширится область их применения. Описываемая техника поможет также в создании более доступных источников ферментов, которые в настоящее время трудно получать в достаточном количестве, что позволит снизить стоимость биосенсоров. [c.89]

Различные комбинации мембран на основе антител и ферментных электродов могут привести к созданию новых автоматизированных сенсоров, чувствительных к антигенам. Такие биосенсоры, возможно сопряженные с сенсорами ферментов печени, позволяют обеспечить быстрое и надежное наблюдение за кровеснабжением. На рис. 1.6 показан иммуносенсор на основе измерения потребления кислорода в присутствии глюкозооксидазы и глюкозы. Таким образом определяют содержание антител поверхностного антигена вируса гепатита В. Описаны и другие электроферментные методы для иммунологических исследований, и это направление, видимо, будет интенсивно развиваться (гл. 14). [c.18]

Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность. Применение бактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения позволяет устранить недостатки, присущие ферментным биосенсорам. При этом отпадает необходимость в получении и очистке ферментов. Однако такие биосенсоры имеют низкую селективность вследствие того, что микроорганизмы, ткани растений и животных являются источниками самых разнообразных ферментов. Кроме того, время отклика биосенсоров на основе тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим. Тем не менее, в последнее время наблюдается повышенный интерес к электродам, содержащим не сами ферменты, а их первозданные источники - биологические материалы. Установлено, что тканевые срезы выполняют функцию биокатализаторов. При этом пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года. [c.504]

Микроорганизмы могут использоваться в качестве биосенсоров и других научных инструментов. Биосенсор — это гибридный прибор, где живые организмы (органеллы, ферменты) связаны с электродами, и биологическая реакция конвертируется в электрический ток. Биосенсоры применяют при определении различных индивидуальных вешеств, поллютантов, контроля газов и жидкостей в медицине, сельском хозяйстве, экологических исследованиях и различных производствах. Примером может служить биосенсор для определения загрязнения (токсичности) на основе люциферазной системы светящихся бактерий. [c.316]

В данную группу сенсоров входят специальные устройства (см. разд. 3.4), состоящие из внутреннего ионоселективного электрода (обычно стеклянного) и соединенного с ним активного гидрофильного слоя. В этом слое один из компонентов анализируемого раствора (как правило, определяемое вещество, хотя и не всегда) превращается в форму, пригодную для потенциометрического измерения при помощи внутреннего ИСЭ. В качестве специфических химических реакций, лежащих в основе работы биосенсоров, обычно используют ферментативные реакции, которые проходят в гидрофильной мембране, содержащей подходящим способом иммобилизированный фермент. Можно применять также биохимические реакции, протекающие непосредственно в клетках или в моделях клеток, липосомах, которые иммобилизированы в тонком слое, прилетающем к ИСЭ, или, наконец, реакции в срезе биологической ткани, прикрепленном к ИСЭ (разд. 8.2). Активный ферментный слой непосредственно контактирует с ИСЭ, как, например, в ферментном электроде (разд. 8.1), или располагается в проточной системе таким образом, чтобы исследуемый раствор вначале соприкасался с слоем иммобилизированного фермента, а затем образующийся продукт реакции определялся при помощи проточного ИСЭ. В последнем случае речь идет об электроде с ферментным реактором [29] (рис. 8.1). ИСЭ можно также применять для определения продуктов ферментативных реакций, происходящих в гомогенной среде. Однако такой случай здесь рассматриваться не будет. [c.238]

Как и у некоторых биосенсоров на основе тканей млекопитающих, срок службы пируватного биосенсора на основе растительной ткани выше, чем у соответствующей системы с выделенным ферментом [30]. При этом увеличение срока службы сенсора достигается без потери его селективности, что объясняется стабилизацией биокатализатора в растительной ткани. Кукурузные зерна, как известно, отличаются высоким содержанием фермента пируватдекарбоксилазы, катализирующего реакцию [c.48]

Хотя гибридомные технологии еще продолжают достаточно активно использоваться, с появлением новых эффективных методов белковой инженерии, в том числе систем отбора белков на основе разнообразных дисплеев и репрезентативных клонотек случайных белковых последовательностей, mAb начинают постепенно сдавать свои позиции. Новые технологии позволяют отбирать антитела требуемой специфичности непосредственно из суспензии фаговых частиц без иммунизации лабораторных животных и при этом получать белки с совершенно новой специфичностью к антигенам, которые неиммуногенны in vivo. Новые подходы дают возможность снять ограничения, накладываемые на производство антител особенностями иммунного ответа живого организма. В последние годы удалось получить большое количество рекомбинантных антител с новыми свойствами значительно уменьшить размер их молекул, а также объединить антитела в поливалентные гибридные комплексы, сильно повысив при этом их авидность. Генно-инженерными методами удалось объединить фрагменты антител с разнообразными аминокислотными последовательностями для обеспечения адресной доставки макромолекул. Такие гибридные молекулы, кроме антител, включают ферменты для активации предшественников цитоток-сичных лекарственных препаратов, токсины, белки вирусных частиц, используемые в генотерапии, и сами могут быть включены в липосомы для повышения эффективности химиотерапии. Рекомбинантные антитела применяют для получения биосенсоров, используемых при мониторинге исследуемых молекул в реаль- [c.409]

Тканевые материалы растительного и животного происхождения успешно используют в качестве биокаталитических компонентов биосенсоров. Биокаталитические материалы этого класса просто создают естественное окружение для представляющего интерес фермента, в результате чего требуемая ферментативная активность заметно стабилизируется. Во многих случаях тканевые биосенсоры служат намного дольше, чем аналогичные биосенсоры с выделенными ферментами. Кроме того, тканевые материалы сохраняют достаточно высокую специфическую активность, необходимую для конструирования некоторых биосенсоров, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях разрушаются. В большинстве случаев эти преимущества достигаются не в ущерб избирательности. Если же в тканевом материале протекают мешающие процессы, разрабатывают специальные меры по увеличению избирательности. В этой главе достоинства тканевых биосенсоров показаны на конкретных примерах. Рассмотрено также несколько биосенсоров на основе таких биокаталитических материалов, как фрагменты животных клеток. Наконец, впервые предложены возможные механизмы транспорта (вход, внутренний перенос и выход) субстрата и продуктов в иммобилизованных клетках ткани. [c.34]

Из-за множества биокаталитических процессов, протекающих в клетках, избирательности действия сенсоров на основе цельных клеток ткани следует уделять особое внимание. Изучение избирательности биосенсора на основе ткани почки свиньи показало его пригодность для определения глутамина в сложных биологических объектах. Специально изучалось влияние большого числа соединений (мочевина, Ь-аланин, Ь-аргинин, Ь-гистидин, Ь-валин, Ь-серин, Ь-глутаминат, Ь-аспарагин, Ь-аспартат, О-аланин, О-аспартат, глицин и креатинин), которые могли бы создавать помехи работе сенсора, но оказалось, что они не дают заметного сигнала. Как известно, в клетках почки свиньи велика концентрация О-аминокислотной оксидазы [16], поэтому проверяли также отклик сенсора на различные О-аминокислоты. В присутствии кислорода и воды этот фермент катализирует окислительное деаминиро-вание нескольких О-аминокислот. Однако в специфических условиях работы глутаминовый биосенсор не обнаруживал чувствительности к проверяемым О-аминокислотам. То, что побочные биокаталитические процессы не влияют на сигнал биосенсора, по всей вероятности, обусловлено отсутствием флавинадениндинуклеотида в буферной системе [23]. [c.37]

Слой мышечной ткани кролика толщиной 0,5 мм содержит приблизительно пять международных единиц АМР-деаминазной активности [10]. В то же время сравнимый объем (25 мкм) коммерческого препарата фермента имеет активность всего 0,1 ед. Такая низкая активность и приводит к плохой чувствительности ферментных биосенсоров. Фактически перед иммобилизацией выделенный фермент приходится концентрировать фильтрацией в течение 16 ч и в результате активность ферментного слоя на поверхности электрода повышается до 0,9 ед. [35]. Но даже после такого концентрирования ферментативная активность в слое ткани остается выше примерно в пять раз. В табл. 3.4 приведены основные характеристики сенсоров АМР на основе различных биокаталитических материалов. Наилучшие эксплуатационные характеристики, в том числе наклон 58 мВ/рС и срок службы не менее 28 дней, достигаются при использовании кусочка ткани, который обладает наибольшей ферментативной активностью из всех приведенных материалов. Напротив, система на основе фермента характеризуется наклоном, составляющим только 46 мВ/рС и всего лишь четырехдневным сроком службы. Таким образом, если выделенные ферменты имеют недостаточную специфическую активность, то более эффективны слои ткани. [c.44]

До сих пор попытки использовать амперометрические биосенсоры на основе алкогольдегидрогеназы [6, 35] для анализа реальных проб были безуспешны. Напротив, алкогольоксидаза (ЕС 1.1.3.13) из различных микробных источников, видимо, вполне пригодна для сенсоров, чувствительных к спирту. Этот фермент катализирует окисление низкомолекулярных первичных спиртов по реакции [c.269]

Привитые поверхностные соединения и материалы на их основе все шире используются в качестве химических и биосенсоров, защитных покрытий (в том числе антикоррозионных), адгезивов и антиадгезивов, самоочищаюпщхся и био-незагрязняемых покрытий, биоматериалов (имплантантов, покрытий медицинских зондов), носителей для иммобилизованных ферментов и клеток, матриц для твердофазного органического синтеза, катализаторов, ненабухающих ионообменников, наполнителей полимеров, загустителей пластичных смазок и др. [c.7]

Кроме активного использования в изучении экспрессии генов, белки-репортеры оказываются незаменимыми помощниками при исследовании, в частности, факторов транскрипции и механизмов передачи сигналов, при поиске новых лекарственных препаратов и конструировании биосенсоров на основе клеток. В принципе, многие ферменты могут быть использованы в качестве репортеров, и их выбор определяется конкретными задачами и возможностями исследователя. Основными критериями выбора являются удобство идентификации белка-репор-тера в составе молекулярной химеры, его стабильность и другие важные качества. К таким свойствам можно также отнести безопасность в отношении окружающей среды, простоту использования, высокую чувствительность при обнаружении и низкую фоновую активность. [c.383]

Наряду с цельными фрагментами тканей млекопитающих в биосенсорах можно эффективно использовать фракции тканевых клеток, иммобилизуя именно те субклеточные компоненты, которые обладают наибольшей биокаталитической активностью. Такой подход может быть весьма плодотворным, если необходимо увеличить количество иммобилизованного фермента или улучшить избирательность сенсора, устраняя мешающие ферменты, которые содержатся в других частях клетки. Показано, что некоторые субклеточные фракции можно использовать как аналитические реагенты. Так. для определения тироксина можно использовать микросомы печени крысы [34]. Первой удачной попыткой создания биосенсора на основе субклеточной фракции был биосенсор для определения глутамина [8]. В этом сенсоре митохондриальную фракцию клеток кортекса почки свиньи иммобилизовали на газоаммиачном датчике. Митохондрии содержат два изофермЬнта глутаминазы [15], активность которых и используют в глутаминовом биосенсоре. [c.53]

Многие биосенсоры работают при постоянном потенциале, что существенно упрощает приборное оформление. Однако при этом всегда наблюдается фоновый ток, величина которого может быть значимой при низких концентрациях определяемого вещества. Коррекция фонового тока и градуировка биосенсоров in vivo-две серьезные проблемы, которые требуют надежного решения. Колебания этих параметров могут быть обусловлены отравлением электрода компонентами среды. Ухудшается также чувствительность и время отклика биосенсора. Если флуктуации базовой линии обусловлены колебаниями концентраций эндогенных электроактивных мешающих частиц, то можно использовать двухэлектродную (дифференциальную) систему. Этот подход использовали при конструировании глюкозного датчика, где один электрод покрыт мембраной на основе глюкозооксидазы, а другой-мембраной, не содержащей фермента. Предполагается, что электроактивные примеси одинаковым образом диффундируют через обе мембраны [60]. В случаях, когда электрод загрязняется примесями из матрицы или продуктом электрохимической реакции, его подвергают многоимпульсной ступенчатой обработке при разных потенциалах [45, 52]. Этот способ позволяет одновременно провести как обработку электрода (в том числе удаление накопившихся на его поверхности пленок), так и установку базовой линии в области потенциалов, в которой отсутствует электролиз. Применяют также различные виды импульсной полярографии, вольтамперометрию (циклическую или с линейной разверткой потенциала). Последняя особенно полезна в двух случаях, описываемых ниже. Многие нейроактивные вещества окисляются при очень близких значениях потенциалов, и поэтому их трудно различить. Полная циклическая вольтамперограмма отражает различие в химических свойствах продуктов электролиза. Она может служить, с одной стороны, для качественного анализа, как отпечаток пальца исследуемой системы [56], а с другой-для количественного описания протекающих в ней электрохимических процессов. Недавно было показано [61], что представляющие интерес для биологии органические молекулы могут концентрироваться на обработанной поверхности электрода. При линейной развертке потенциала осадок определяемого вещества удаляется с поверхности, давая четко выраженный пик. [c.146]

В биосенсорах на основе LMO (декарбоксилирующий фермент, часто называемый лактатоксидазой) иммобилизованный фермент закрепляют на поверхности кислородного электрода Кларка [36, 62]. Для такого сенсора авторы [36] получили линейную зависимость сигнала от концентрации при содержании лактата в измерительной ячейке до 0,25 ммоль/л. Для образцов реконструированных сывороток крови человека коэффициент корреляции между измеренными и истинными концентрациями г = 0,995 (у = 1,094х — 0,128 ммоль/л). Однако, как и во всех сенсорах на основе Оз-электрода, могут возникать проблемы, связанные с разным содержанием кислорода в буферном растворе и исследуемом образце. [c.264]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология