Амплификация последовательностей ДНК

Как видно из всего представленного в этой главе материала, в последние несколько лет было разработано много новых подходов амплификации последовательностей нуклеиновых кислот как с помощью различных вариантов ПЦР, так и альтернативных методов, включая изотермическую амплификацию. Методы амплификации, с помощью которых в ряде случаев можно заменять традиционное клонирование и осуществлять детекцию специфических последовательностей, становятся все менее трудоемкими, более быстрыми и чувствительными. Прослеживается тенденция к автоматизации всех указанных процессов. Метод ПЦР стал незаменимым в молекулярно-генетических исследованиях, и пока не видно предела его дальнейшему совершенствованию и развитию. [c.250]

Одновременная амплификация последовательностей целого генома [c.239]

Праймеры для ПЦР обычно имеют длину 20 нуклеотидов. Можно синтезировать и более длинные затравки, но они редко бывают необходимы. К 5 -концу праймера можно присоединить последовательность, не комплементарную исследуемому образцу. Такие последовательности включаются в двухцепочечные продукты ПЦР, что обеспечивает возможность введения сайтов рестрикции [3] или регуляторных элементов (к примеру, промоторов в концы амплифицированных последовательностей [6]). Если о подлежащей амплификации последовательности имеется [c.179]

ВИИ ионов Mg2+) при повышенной температуре (50-70°С), что особенно удобно в случае амплификации последовательностей с высоким G -составом и сложной вторичной структурой. Вариант метода с раздельной обратной транскрипцией и ПЦР подходит для исследования сложных смесей РНК или при необходимости транскрибирования очень длинных последовательностей. В данном случае обратную транскрипцию проводят в условиях, полностью оптимизированных для этих ферментов, чего не удается сделать при проведении обеих стадий реакции в одной пробирке. [c.212]

Амплификация последовательностей с неизвестной первичной структурой [c.233]

Рис. 30. Амплификация последовательностей геномной РНК вируса иммунодефицита человека [311] О(3-репликазой [162]

Роль амплификации последовательностей ДНК в эволюции генома. Сходные последовательности в пределах одного генома в принципе могут возникать как независимо, так и при копировании исходной уникальной последовательности ДНК-после-довательности- родоначальника . Вероятность того, что две сходные последовательности возникли независимо, тем меньше, чем больше их сходство и длина. Нет сомнений, что именно увеличение числа предковых последовательностей привело к появлению семейств сходных последовательностей, которые составляют значительную часть современных геномов. Увеличение числа копий сегментов ДНК в ходе эволюции или в процессе эксперимента называется амплификацией. За амплификацию последовательностей в составе кластеров или последовательностей, рассеянных по новым геномным локусам, отвечают разные механизмы (гл. 10). Если основная последовательность удовлетворяет физиологические потребности организма, то образование дополнительных ее копий в геноме не приводит к особым преимуществам- подразумевается, что все эти копии, кроме одной, не содержат мутаций, включая нуклеотидные замены, делеции и вставки. Одна измененная копия может быть нефункциональной или выполнять какие-то новые функции либо служить регуляторным элементом. Если такие измененные последовательности окажутся полезными, то они сохранятся под давлением отбора. В противном случае эти последовательности следует отнести к псевдогенам. Таким образом, амплификация ДНК создает основу для эволюции. [c.159]

Современное руководство по биотехнологии, написанное авторитетными канадскими учеными. В книге подробно изложены основы генной инженерии механизмы репликации, транскрипции и трансляции методы клонирования, амплификации и секвенирования ДНК конструирование рекомбинантных ДНК введение последовательностей-мишеней в геном микроорганизмов, растений и животных, а также практическое применение генной инженерии для получения лекарственных веществ, вакцин, факторов роста, инсектицидов и т.д. Большое внимание уделено генной терапии и связанным с ней морально-этическим проблемам, патентованию биотехнологических продуктов и способов их получения. [c.4]

Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК [c.80]

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза одноцепочечных ДНК-фрагментов с заданной нуклеотидной последовательностью методология молекулярного клонирования и характеризации ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов [c.80]

Использование с этой целью векторов ВРУ-типа удобно в том отношении, что довольно быстро устанавливается множество копий вируса (до нескольких сотен на клетку). Этим объясняется успешное применение вектора на основе ВРУ для высокоэффективной экспрессии многих белков [1]. Недостатки вирусных векторов связаны с ограниченным набором клеточных линий, в которых возможна репликация вектора, а уровень экспрессии и поддержание эписомного состояния конструкции в целом зависят кроме всего прочего и от конкретных последовательностей ДНК, клонированных в векторе. Альтернативный способ увеличения числа копий, описанный в данной главе, предусматривает селекцию клеток на амплификацию последовательностей вектора после его интеграции в ДНК клетки-хозяина такой подход не имеет принципиальных ограничений на использование того или иного типа клеток. При этом подходе можно выбрать клетки с любыми нужными свойствами, например способностью определенным образом модифицировать белковый продукт или узнавать конкретную регуляторную последовательность ДНК. [c.239]

Примерно десятую часть продуктов реакции амплификации исследуйте при помощи электрофореза в агарозном геле. Во многих случаях получается одна полоса, окрашенная бромистым этидием. Можно даже примерно рассчитать количество амплифицированной ДНК- Обычно при амплификации последовательности длиной 1 т. п. н. из 0,3 мкг геномной ДНК млекопитающих получают 1 мкг амплифицированной последовательности. При амплификации маленького фрагмента ДНК последовательно с двумя парами праймеров (внутренних и внешних) можно получить несколько микрограмм такого внутреннего фрагмента. Иногда в геле обнаруживаются дополнительные полосы, происхождение которых неизвестно. Однако они не мешают анализу специфических фрагментов методом РНКазного расщепления или ДГГЭ. При использовании метода nested oligo такие полосы не появляются. [c.144]

В простых случаях подходы, основанные на протоколах стандартной ПЦР, разработанные К.Б. Мюллисом и др., как правило, дают хорошие результаты при амплификации последовательностей, длина которых не превышает 3 т.п.о. Такой метод наиболее применим для амплификации коротких последовательностей, любых последовательностей в составе гомогенных векторных молекул на основе плазмид и хромосом бактериофагов, а также при реамплификации продуктов ПЦР. В этом случае точное следование прописи является гарантией получения нужного ПЦР-продукта. [c.207]

Этот вариант ПЦР разработан для амплификации последовательностей ДНК или РНК непосредственно на фиксированных препаратах тканей, клеток или хромосом [284, 285]. Если с помощью обычной гибридизации in situ с использованием меченой ДНК в качестве зонда можно обнаруживать до 10 копий анализируемых последовательностей на клетку, то чувствительность ПЦР in situ в 10 раз выше, т.е. позволяет обнаруживать одну ко- [c.213]

Для амплификации последовательностей с использованием обычной ПЦР необходимо знание первичной структуры обеих последовательностей, фланкирующих анализируемый ампликон, что является существенным ограничением использования метода в анализе последовательностей неизвестной структуры. В исследовательской работе часто встречаются ситуации, когда известна последовательность, расположенная с одной стороны ампликона, а другую требуется определить, то есть совершить переход от известной последовательности генома к соседней неизвестной. Для решения этой задачи создано несколько методов, объединенных под общим названием односторонней ПЦР (single-sided P R). [c.233]

Синтез РНК, осуществляемый рр-репликазой, характеризуется очень высокой эффективностью. В общем случае удается получать 107-108 копий исходной последовательности. При этом репликация может начинаться с одной молекулы. Однако реализация этого метода сталкивается с рядом технических трудностей. В частности, сама р(3-репликаза является сложноустроенным четырехсубъединичным ферментом и не всегда доступна. Кроме того, имеется целый ряд ограничений, накладываемых на последовательности анализируемой РНК, что вызвано соблюдением структурных особенностей молекул, распознаваемых репликазой. Все это ограничивает широкое распространение системы в анализе ДНК. Тем не менее, этот подход в будущем может оказаться весьма полезным в тех случаях, где требуется очень высокий уровень амплификации последовательностей при постоянной температуре, а в настоящее время он успешно используется для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека. [c.249]

Таким образом, амплификация последовательностей ДНК in vitro находит широкое применение как в экспериментах по клонированию в составе молекулярных векторов, так и для прямого анализа вариантных состояний генов. Особое значение рассмотренный методический подход имеет при разработке простых тест-систем для выявления в организме нуклеиновых кислот инфекционных агентов. В настоящее время такие анализы стали рутинными. Многочисленные фирмы производят тест-системы для идентификации методом ПЦР (или ОТ-ПЦР) практически всех известных микроорганизмов, вызывающих заболевания человека и животных. В частности, этот подход используют для ранней диагностики наличия в организме вируса имм шодефицита человека (HIV), что не удается осуществить другими методами. При этом не требуется работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения фрагментов ДНК и окраски их бромистым этидием. [c.54]

Геном млекопитающих содержит несколько разных семейств коротких повторов. Короткие повторы у птиц и амфибий изучены значительно хуже. Число копий коротких повторов, например наиболее изученных повторов Alu-семейства у человека, составляет 3-10 , что соответствует 5—6% массы ДНК клетки. Такие повторы рассеяны по геному и получили название вездесущих. Повторы Alu могут находиться в интронах, на 5 -флангах генов и, наконец, в составе З -нетранслируемого участка мРНК- Нуклеотидная последовательность Alu-повтора гомологична последовательности отдельных участков 7S РНК. Структура 7S РНК достаточно консервативна у позвоночных, а гомологии в нуклеотидной последовательности прослеживаются и с 7S РНК насекомых, Поэтому семейства коротких повторов, присутствующие у разных видов, предшественником которых служила 7S РНК, также могут обладать достаточной гомологией. В то же время семейства коротких повторов, как и длинных, характеризуются видоспецифичностью, обусловленной амплификацией той или иной копии клеточных РНК, которые к тому же могли быть по-разному модифицированы в результате процессинга. Локализация ретропозонов, внедрившихся в отдельные сайты генома у предков млекопитающих, может, по крайней мере, частично сохраняться в процессе дальнейшей эволюции. Например, места локализации Alu-подобного семейства в межгенных про.межутках кластера глобиновых генов оказались достаточно сходными у мышей и приматов. [c.226]

Незначительные ограничения этого метода компенсируются информацией, которая может быть получена из независимых анализов комплиментарных цепей. Применение ферментов в этом методе ограничивается введением метки в концевой фосфат и рестрикционным расщеплением цепей на блоки подходящей длины, примерно в 100—150 остатков, с частичным их перекрыванием. Метод нашел наибольшее применение в определении последовательности оснований контролирующих областей генов, например для исследования дуплекса в 223 пары оснований, представляющего собой ген 5S РНК пекарских дрожжей и имеющего промоторный и тер-минаторньй участки транскрипции [24]. Другой прекрасный пример использования этого метода — установление полной первичной структуры -глобиновой мРНК кролика, структура которой была закреплена получением с помощью транскриптазы соответствующей ей циклической ДНК [25]. В ходе амплификации этой циклической ДНК клонированием бактериальных плазмид (см. разд. 22.3.4) были потеряны 13 остатков с 5 -конца. К счастью, их последовательность удалось установить в результате исследований с использованием метода плюс и минус [26]. Совместное применение этих методов позволило установить последовательность гена длиной в 589 пар нуклеотидов. [c.192]

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация - иногда в миллионы раз - осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса. Для ПЦР необходимы 1) два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по 20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующим последовательность-мишень их 3 -гидроксильные концы после отжига с ДНК должны быть ориентированы навстречу друг другу 2) ДНК-мишень длиной от 100 до -35 ООО п. п. 3) термостабильная ДНК-по-лимераза, которая не теряет своей активности при температуре 95° и выше 4) четыре дезокси-рибонуклеотида. [c.94]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология