Бромциан сефароза

Производные сефарозы, готовые для прямого присоединения аффинных лигандов, перечислены в табл. 8.2. Из новых носителей предложена активированная бромцианом сефароза 6МВ (макро-гранулированная сефароза 6В размер частиц 200—300 мкм) она предназначена для аффинной хроматографии клеток. Активированная тиол-сефароза 4В (смешанный дисульфид, образованный [c.185]

Изучение влияния концентрации е-амино-капроновой кислоты на ее связывание активированной бромцианом сефарозой показало, что высокая концентрация аффинного лиганда при коротком времени инкубации дает лучшие результаты, чем низкая концентрация при продолжительной инкубации. [c.192]

В качестве иллюстрации рассмотрим пример иммуноадсорбции, Куатреказас [4] выделял инсулин на колонках с сефарозой, содержащей антитела против свиного инсулина, привязанных при pH 6,5 и 9,5. Как показано в разд. 8.2.4, белок привязывается к активированной бромцианом сефарозе аминогруппами в непрото-нировапной форме. При понижении pH происходит также уменьшение числа связывающихся групп. Различие в pH привязки бел- [c.74]

АктиБированная бромцианом сефароза 4В поступает в продажу в виде лиофильно высушенного продукта, содержашего декстран и лактозу, которые перед исполь.чованием следует отмывать. Ниже приводится методика для привязки аффинного лиганда к активированной бромцианом сефарозе, предлагаемая фирмой РЬагтас1а. [c.190]

Количество связанного аффинного лиганда зависит от содержания его в реакиионн.ой смеси и объема геля, pH реакции, природы присоединяемого лиганда (числа реакционных групп и т. п.), а также от времени реакции и температуры. Например, при присоединении химотрипсина к 2 мл активированной бромцианом сефарозы при pH 8 из 10 мг присутствующего белка присоединяется только 5 мг, из 20 мг— 8 мг, а нз 30 мг— 10 мг. При комнатной температуре (20—25 °С) присоединение обычно заканчивается за 2 ч, в то время как при более низких температурах рекомендуется оставлять реакционную смесь на ночь. Реакционную смесь следует перемешивать, однако не рекомендуется использовать магнитную мешалку, так как это может привести к механической деструкции геля. [c.190]

Связывание фермента, меченного флуоресцеином, на активированных бромцианом сефарозе или сефадексе осуществляют аналогично связыванию немечен-ного фермента. Меченные флуоресцеином антитела связывают на ферменте, иммобилизованном на матрице, из 0,1 М раствора бикарбоната атрия. Неразбавленную меченую антисыворотку смешивают с равным объемом суспензии фермента, связанного с нерастворимым носителем, и термостатируют 1 ч при 37 °С и еще 12 ч при 4 °С. После перенесения материала на стеклянный фильтр неспецифически сорбированные компоненты удаляют интенсивным промыванием 0,1 М бикарбонатом натрия. [c.255]

Если в качестве аффинного лиганда используется кофактор, согласно данным Лоу и Дина [57], очень важно, чтобы нативная конформация, кофактора сохранялась даже после его связывания. Это справедливо также в том случае, если аффинным лигандом является биологически активный белок. Он должен быть присоединен к носителю минимально возможным числом связей, так как при этом увеличивается вероятность сохранения нативной третичной структуры белка. В качестве примера приведем работу Куатреказаса по выделению инсулина [14] на колонке с сефарозой с присоединенными при pH 6,5 или 9,5 антителами к свиному инсулину. Как будет показано ниже, белок связывается с активированной бромцианом сефарозой посредством непротонированных аминогрупп. Снижение pH уменьшает число связавшихся групп. Различия в величинах pH в процессе присоединения приводят к тому, что первое производное (pH 6,5) характеризуется почти 80%-ной теоретически возможной емкостью по инсулину, в то время как у второго производного (pH 9,5) эта емкость равна только 7%. Поскольку общее содержание белка одинаково в обоих случаях, второе производное должно содержать иммуноглобулин, который не способен [c.11]

Отмытую И декантированную сефарозу суспендируют в дистиллированной воде (1 1). Работу ведут под тягой. В суспензию сефарозы погружают электроды рН-метра и при постоянном перемешивании прибавляют к ней небольшими порциями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). Добавляя раствор гидроксида натрия, pH суспензии поддерживают примерно около И. Для 5—10 мл сефарозы и 1—3 г бромциана рекомендуется 2М раствор гидроксида натрия, для 100—200 мл сефарозы и 20—30 г бромциана — 8М его раствор. Температура должна быть равна примерно 20 °С если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается через 8—12 мин. Далее Куатреказас рекомендует добавить большое количества льда и быстро перенести суспензию в воронку Бюхнера. Активированную сефарозу промывают при постоянном отсасывани предварительно охлажденным буферным раствором того же состава, который используют при последующем связывании аффинного лиганда. Объем буферного раствора, расходуемый на промывку сефарозы, должен в 10—15 раз превышать объем раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытую сефарозу как можно быстрее суспендируют в равном объеме раствора аффинного лиганда. Связывание ведут при постоянном перемешивании при пониженной температуре (4°С) в течение 16—20 ч. Согласно данным Куатреказаса [14], промывка, добавление раствора аффинного лиганда и смешивание не должны длиться более 90 с. Даже при пониженной температуре активированная сефароза неустойчива. Связывание аффинного лиганда с активированной бромцианом сефарозой более подробно рассматривается в лоследующих разделах. [c.17]

Специфические антитела против IgG человека выделяют методом аффинной хроматографии на колонке с им.муносорбентом (бромциан сефароза с иммобилизованным IgG человека). [c.268]

Наибольшее распространение получила ю-аминоал-кил-сефароза, продукт присоединения алифатических диаминов с различ1НОЙ длиной цепи к активированной бромцианом сефарозе. Полученные производные содержат аминогруппы, к которым при помощи карбодиимида можно присоединять лиганды, имеющие свободный карбоксил (схема VI). Кроме того, если лиганд является [c.219]

Наиболее распространенный способ пришивания лиганда к матрице заключается в предварительной обработке полисахаридной матрицы бромцианом ( NBr) при pH И,О (в продаже имеется активированная бромцианом сефароза 4В). [c.102]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология