Метод аффинной хроматографии

Принцип метода аффинной хроматографии, историческая справка и применение [c.15]

Сложная молекулярная структура белков делает их очень интересным объектом для изучения процессов связывания с сорбатом. Метод аффинной хроматографии был развит на основе представлений о способности пар белок—лиганд образовывать весьма прочные комплексы. Подобные пары можно обнаружить во многих природных системах, это, например, такие пары, как фермент— субстрат, фермент—кофактор, гормон—рецептор и т. д., но, как [c.131]

Несмотря на объективные недостатки, метод аффинной хроматографии во многих случаях не имеет альтернативы в биохимическом анализе. С методиками приготовления аффинных сорбентов, техникой эксперимента и конкретными примерами практического применения метода можно познакомиться в специальных изданиях [89, 96]. [c.202]

Белки, регулирующие матричную активность, осуществляющие репликацию, транскрипцию и трансляцию НК, а также их репарацию и процессинг, являются сейчас объектом столь многочисленных исследований, что это оправдывает выделение методов их очистки и фракционирования методом аффинной хроматографии в отдельный раздел. [c.420]

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

Методом аффинной хроматографии можно выделять синтетические пептиды, способные образовывать комплекс [c.415]

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

Целлобиазы ( -глюкозидазы), как правило, имеют существенно более высокую молекулярную массу (120-180 кЛа), которая может в несколько раз возрастать за счет склонности фермента к ассоциации с образованием комплексов. Изоэлектрические точки многих целлобиаз лежат в близкой к нейтральной области, хотя большинство ферментов имеют р1 4,5-5,5. По адсорбционной способности целлобиазы значительно уступают другим компонентам целлюлазного комплекса, что позволяет выделять их методами аффинной хроматографии на целлюлозе. Биохимические характеристики ферментов из ряда микробных источников приведены в табл. 5.1. [c.121]

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. 4. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [c.19]

Основные соотношения, полученные для одноразового метода аффинной хроматографии, применимы также и для колоночной хроматографии. [c.35]

Поэтому я очень рада выходу книги на русском языке, что, как я надеюсь, в значительной мере увеличит число поклонников метода аффинной хроматографии, которым я бы хотела пожелать больших успехов в дальнейшем при применении и развитии этого действительно очень перспективного метода. [c.7]

Инертный носитель может быть полиуретаном или полимером другого типа либо природным полимером (например, коллаген, легко выделяемый из шкур животных). Подвижный мостик присоединен к функциональной группе на полимерном геле. Длина мостика — важный параметр, так как свободный конец должен быть способен образовать ковалентную связь с функциональной группой фермента, не влияя на ферментативную активность. Такой фермент, пришитый к матрице, обычно называют иммобилизованным, ферментом [122—125]. В отличие от широко распространенного метода аффинной хроматографии в данном случае фермент, а не субстрат ковалентно сшпт с твердым носителем. Однако принцип биоспецифического узнавания тот же. [c.257]

Рис. 7.6. Хроматографическое выделение химотрипсина на незамещенной сефарозе (а) и выделение того же соединения методом аффинной хроматографии на сефарозе, с привитым метиловым эфиром е-аминокаприл-В-триптофана (б)

Родственные методы аффинной хроматографии [c.155]

Первоначально передо мною стояла цель сделать обзор выделенных методом аффинной хроматографии веществ, а также кратко обсудить наиболее существенные моменты, знание которых необходимо для усиеплного применения этого метода. Однако изучение литературы привело меня к мысли о том, что аффинная хроматография далеко не ограничивается выделением веществ. В связи с тем что в ее основе лежит образование специфических комплексов, например ферментов с их ингибиторами, антител с антигенами, лектинов с сахарами и гликопротеинами и т. д., аффинная хроматография является весьма полезной также и при изучении этих специфических взаимодействий. [c.7]

В последние десять лет метод аффинной хроматографии [23— 27] играет важную роль при выделении биологически активных белков. В этом методе колонки заполняют нерастворимым носителем, с которым ковалентно связаны лиганды, обладающие сродством к выделяемому белку (так называемые аффинные лиганды). Когда раствор смеси различных веществ проходит через такую колонку, на ней сорбируется лишь интересующий исследователя белок, а все остальные соединения вымываются. Сорбированный на колонке белок выделяют, либо нарушая взаимодействие макромолекулы с иммобилизованным лигандом, либо воздействуя на него конкурирующим лигандом, присутствующим в элюирующем буфере. Такого рода специфические взаимодействия возникают между ферментами и их ингибитора- [c.109]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

Специфичность методов аффинной хроматографии наряду с избирательной сорбцией кетоаминной фракции НЬ Ale на ПААГ определяется спектрофотометрической детекцией гема, имеющего максимальную величину оптической плотности при длине волны 415 нм. Это обстоятельство позволяет избежать искажения результатов анализа за счет присутствия других гликолизированных белков эритроцитов или плазмы крови. [c.67]

Методы аффинной хроматографии, основанные на реакциях антиген — антитело, открыли новое направление и новые возможности применения иммуноадсорбции. Принципы и условия использования иммунной аффинной хроматографии при иммобилизации антител или антигенов описаны в литературе [70, 75]. Два варианта применения иммуноаффииной хроматографии схематически представлены на рисунке 4.10. [c.109]

Вылепенне лектинов чаще всего проводится методом аффинной хроматографии с использованием в качестве лиганда соответствующего сахарида. [c.472]

Иммунологическое родство между двумя энтеротоксинами настолько велико, что антисыворотка к холерному токсину использоваться может для выделения энтеротоксина Е. oli методом аффинной хроматографии. Существует общность тех участков структуры двух токсинов, которые несут в себе антигенные детерминаторы. [c.366]

Пептиды из нитрованного лизоцима, содержащие остатки нитротирозина, выделяли на сефарозе (Sepharose) с иммобилизованными антителами [45] (рис. 34.16). Антитела получали иммунизацией кроликов и коз комплексом нитротирозин—белок. Антитела выделяли из сыворотки методом аффинной хроматографии на сефарозе с фиксированным нитро-у-глобулином [46]. После десорбции 0,1 М уксусной кислотой антитела конденсировали с сефарозой, получая, таким образом, иммуносорбент. Последний использовали для выделения в одну стадию пептидов с остатком нитротирозина. [c.415]

Тирозин — аминотрансферазу выделяли методом аффинной хроматографии на пиридоксаминфосфатагарозе (сефарозе 4В) [61]. Фермент элюировали, изменяя состав буферного раствора. Препарат, прошедший на этой стадии 125-кратную очистку, подвергали далее гель-фильтрации на сефадексе G-200. ь-Тирозин-2-оксоглутарат—аминотрансфераза была выделена в виде смеси нескольких изоферментов. [c.19]

В последние годы метод аффинной хроматографии благодаря своей высокой эффективности стал одним из ведущих методов выделения и очистки природных соединений. Его применение, однако, не ограничивается только выделением соединений, находящихся— часто в очень небольших концентрациях — в смеси с близкими к ним но свойствам веществами. Специфическое комплексооб-разованне позволяет применять этот метод и для отделения биологически активных молекул от денатурированных, например после модифицирования белка, а также и для исследования самого процесса комплексообразования, определения констант устойчивости комплексов и установления различных факторов, оказывающих влияние на этот процесс. [c.5]

Другим методом аффинной хроматографии, использующим образование специфического комплекса макромолекулы выделяемого вещества с аффинным лигандом, является биоспецифическое элюирование с неспецифических сорбентов этот метод известен как аффинное элюирование и в некоторых случаях как специфическое элюирование субстратом [54]. В основе метода лежит неспецифичеакое связывание, например, слмеси ферментов полимером, который несет на себе функциональные группы, взаимодействующие с ферментами. Требуемый фермент затем специфически элюируют растворол субстрата, ингибитора или какого-либо другого аффинного лиганда. [c.160]

ДЛЯ выделения арабиногалактана, связанного с белком (из Gladiolus). Хроматографирование проводили на колонке с носителем, полученным присоединением этого лектина к сефарозе 4В, что демонстрирует потенциальные возможности метода аффинной хроматографии при изучении растительных полисахаридов [195]. Некоторые примеры исследований в этом бурно развивающемся направлении приведены в табл. 7.4. [c.36]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология