Бромциан, активация сефарозы

Активация сефарозы бромцианом [c.347]

Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости по связыванию небольших пептидов [1], прямо пропорциональна pH. Активация проводится при pH 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2, 12, 55]. [c.189]

Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда, стерические препятствия и т. д.) оно же может также влиять и на структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2 до 8,5 во время связывания белка после активации бромцианом. [c.274]

Нативная сефароза или сефароза, блокированная этанолами-ном сразу же после активации бромцианом, не адсорбируют белки [16]. Однако, если сефароза не блокирована тотчас же после активации, наблюдается неспецифическая сорбция белков, которая становится тем сильнее, чем больше проходит времени между активацией бромцианом и блокированием активных центров. Препарат человеческий сывороточный альбумин—сефароза, блокированный после 12 ч после присоединения сывороточного альбумина,, сорбирует только 0,4 мг белка на 1 мл геля. [c.277]

Свойства гидроксильных групп этого геля аналогичны свойствам гидроксильных групп агарозы. После активации бромцианом они, как и гидроксильные группы сефарозы, могут связываться с аминогруппами белков [88]. [c.24]

Зависимость количества связанного с сефарозой фермента и его активности от степени активации носителя бромцианом [c.82]

Неподвижная фаза в А. х. представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме носитель-соединяющее звено ( ножка )-специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или ножки , содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом [c.221]

Отмытую И декантированную сефарозу суспендируют в дистиллированной воде (1 1). Работу ведут под тягой. В суспензию сефарозы погружают электроды рН-метра и при постоянном перемешивании прибавляют к ней небольшими порциями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). Добавляя раствор гидроксида натрия, pH суспензии поддерживают примерно около И. Для 5—10 мл сефарозы и 1—3 г бромциана рекомендуется 2М раствор гидроксида натрия, для 100—200 мл сефарозы и 20—30 г бромциана — 8М его раствор. Температура должна быть равна примерно 20 °С если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается через 8—12 мин. Далее Куатреказас рекомендует добавить большое количества льда и быстро перенести суспензию в воронку Бюхнера. Активированную сефарозу промывают при постоянном отсасывани предварительно охлажденным буферным раствором того же состава, который используют при последующем связывании аффинного лиганда. Объем буферного раствора, расходуемый на промывку сефарозы, должен в 10—15 раз превышать объем раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытую сефарозу как можно быстрее суспендируют в равном объеме раствора аффинного лиганда. Связывание ведут при постоянном перемешивании при пониженной температуре (4°С) в течение 16—20 ч. Согласно данным Куатреказаса [14], промывка, добавление раствора аффинного лиганда и смешивание не должны длиться более 90 с. Даже при пониженной температуре активированная сефароза неустойчива. Связывание аффинного лиганда с активированной бромцианом сефарозой более подробно рассматривается в лоследующих разделах. [c.17]

Однако такой подход не экономичен, поскольку требует расходования больших количеств чистого белка-антигена для образования геля. Естественнее использовать в качестве твердой фазы один из продажных гидрофильных гелей и на его поверхности химически закрепить антитела, за которые будет идти конкуренция. Такое закрепление можно осуществить, например, с помощью известной реакции активации сефарозы бромцианом. Она практически не нарушает иммунореактивности антител. [c.287]

Для хроматографии рибосомальной РНК и для выделения плазминогена ]1роизводится лизин—сефароза 4В путем связывания ь-лизина с сефарозой 4В после активации бромцианом. Концентрация связанного лизина составляет 4—5 мкмоль на 1 мл набухшего геля. Лизин—сефароза 4В поставляется в виде лио-филизованного норощка пакетах по 15 г, что эквивалентно 60 мл набухшего геля. Порошок содержит добавки для сохранения способности геля к набуханию. При хранении сухого геля при температурах <8°С не наблюдается никакой заметной потери связанного лиганда даже через 1 год хранения. [c.141]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

В работе Лоу и др. [42] сопоставлены свойства сорбентов на основе целлюлозы и сефарозы, для чего использовались экспериментальные кривые титрования 6-аминогексил-МАО+—сефарозы, немодифицированной сефарозы, 6-аминогексаноил — сефарозы и соответствующих производных целлюлозы (рис. 8.1). Очевидно образование ионизирующих групп после активации бромцианом это было также показано в случае целлюлозы, когда для реакции присоединения использовали дициклогеисилкарбодиимид [38]. Отклонение, наблюдаемое для сефарозы, существенно меньше, [c.180]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология