Ретровирусы векторы на их основе

Рис. 14.43. Молекулярные векторы ретровирусов на основе провирусной ДНК вируса лейкемии мышей,

Конструирование векторов на основе ретровирусов. В основе конструирования ретровирусных векторов лежат три важных принципа. Во-первых, векторы должны сохранять последовательности вирусного генома, необходимые для репликации, экспрессии генов и упаковки. Синтез вирусных белков может определяться генами, находящимися в 7и/>йис-положении. Во-вторых, чужеродные сегменты ДНК должны встраиваться в кодирующие области генома или отчасти замещать их. В-третьих, ретровирусные векторы обычно предназначены для использования в качестве трансдуцирующих векторов с упаковкой рекомбинантного генома в вирион. Сами ретровирусы представляют собой природные трансдуцирующие вирусы они рекомбинируют с клеточными геномами и трансдуцируют клеточные гены во вновь инфицируемые клетки как часть провируса. [c.268]

Экспертному совету FDA предстоит принять решение о том, как эти неприятные события скажутся на судьбе остальных исследований по генной терапии в США. Американское общество генной терапии также срочно формирует комитет экспертов для проверки всех данных по применению векторов на основе ретровирусов в генной терапии и инженерии (прежде всего — выведении трансгенных [c.134]

Еще один важный результат, который был получен при исследовании ретровирусов,- создание на их основе рекомбинантных векторов (разд. 5.7. г). Эти векторы оказались особенно ценными для введения новых генов в эмбрионы млекопитающих на ранних стадиях развития, а значит, практически во все клетки организма, включая клетки зародышевой линии получающиеся при этом животные называются трансгенными. Роль трансгенных животных в исследовании тканеспецифичной экспрессии генов и действия онкогенов описана в гл. 8. [c.351]

Результаты генной терапии можно рассмотреть на конкретном примере. У мальчика, больного гемофилией из-за дефицита девятого фактора свертывания крови, с помощью биопсии были выделены фибробласты кожи и культивированы в клеточной культуре, В эти клетки был введен искусственный вектор, созданный на основе ретровируса и содержащий гены, которые увеличивают активность девятого фактора. Инфицированные клетки были размножены в клеточной культуре и возвращены в организм мальчика подкожно в районе спины и ягодиц. Клетки прижились, в результате была увеличена активность девятого фактора свертывания крови, и симптомы гемофилии у пациента были сглажены. Таким образом, генно-инженерные работы создают подходы к лечению гемофилии человека. [c.74]

Г. Векторы на основе ретровирусов [c.267]

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

Вопрос о применении геной терапии всегда вызывал споры, но большинство ученых согласны с Т. Фридманом и Р. Роблином, которые еще в 1972 г. (S ien e 175 949-955) писали Мы считаем, что геная терапия сможет облегчить симптомы некоторых наследственных заболеваний человека, поэтому необходимо продолжать исследования, направленные на ее развитие. Ключевые моменты генной терапии — адресная доставка терапевтического гена и обеспечение его экспрессии в определенных клетках или тканях. Сначала в качестве основного средства доставки терапевтических генов рассматривали векторы, полученные на основе вирусов человека. Это было связано с наличием у них механизмов проникновения в специфические foieTKH. Наиболее многообещающими считали векторы на основе ретровирусов. Но нативный ретровирус - это инфекционный агент, который по- [c.492]

Вы познакомились с основными приемами и способами модификации генома микробных, растительных и животных клеток. Для биотехнологии большое значение представляет создание суперпродуцентов на основе микробных и растительных клеток, способных синтезировать любые белковые вещества, имеющие практическое значение. Генная инженерия дает возможность не только создания новых, отсутствующих в природе продуцентов целевых продуктов, но и существенного увеличения эффективности уже существующих производств. Например, способом повышения продуктивности того или иного продуцента является амплификация, т е. увеличение числа копий генов, кодирующих целевой продукт. Можно еще раз подчеркнуть огромные возможности генной инженерии для создания вакцин на основе синтетических антигенов, трансгенных растений с заранее заданными свойствами, а также транс-генных животных. В дополнение следует отметить использование методов генной инженерии в диагностике некоторых заболеваний, например вирусных инфекций, а также для лечения ряда наследственных заболеваний. В связи с этим появился даже новый термин генная терапия. Для лечения наследственных болезней необходимо дефектный ген заменить на нормально функционирующий. В качестве векторов обычно используют РНК-ретровирусы, которые вводятся в стволовые клетки костного мозга. [c.507]

Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последовательностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов называют трансфекцией Альтернативный метод — использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая клетка инфицируется — (заражается) вирусом В качестве векторов при этом чаще используют литические вирусы типа вируса полиомы и SV40, а также челночные векторы, сконструированные на основе ретровирусов и папилломавирусов [c.202]

Из одиннадцати пациентов доктора Фишера девятерых мальчиков (включая двоих, у которых теперь обнаружили лейкемию) лечили этим способом, причем их самочувствие при постоянном контроле все время было отменным. Когда поступило сообш ение о первом случае лейкемии, многие специалисты сочли это простым совпадением. Но доктор К. фон Калле из детской больницы Цинциннати (штат Огайо, США) отмечает, что анализ клеток в обоих случаях свидетельствует, что рак вызван, по всей вероятности, одним и тем же молекулярным сбоем молекулярный вектор (биологический переносчик) на основе ретровируса, использованный для доставки корректирующего гена в организм пациента, внедрился в тот участок его ДНК, где находится печально известный ген LM02, способный, по мнению специалистов, вызывать лейкемию у детей. Ученые сегодня убеждены — болезнь, признаки которой обнаружены у обоих мальчиков, настолько напоминает лейкемию, что пока решено классифицировать ее именно так. По оценкам доктора фон Калле, вектор локализуется рядом с геном LM02 с вероятностью примерно 10 т. е. дефектной оказывается по крайней мере одна из 100 тыс. клеток. А поскольку каждый из пациентов при таком методе лечения получал около миллиона скорректированных клеток, ясно, что некоторые из них могли оказаться дефектными . Фон Калле провел тщательное исследование анализов всех пациентов, которых лечили подобным образом (во всем мире их 15 человек), пытаясь обнаружить присутствие дефектных клеток. [c.134]

Гельсингера, наступившей в результате генной терапии с применением аденовируса (вызывающего обычные ОРЗ) как средства доставки лечебного гена. А теперь епде более грозная и неприятная сенсация — лейкоз у двух детей, лечившихся в Европе от врожденного иммунодефицита. В этих испытаниях вектором, т. е. биологическим переносчиком, служила конструкция на основе ретровируса. В отличие от большинства векторов (как вирусной, так и другой природы) ретровирусы внедряются в геном реципиента — видимо, именно с этим и связано возникновение лейкоза. [c.137]

Описано несколько различных упаковывающих клеточных линий для получения чистых препаратов ретровирусных векторов семейства MLV [17, 19, 21, 32]. Из них наиболее широкое применение нашли, пожалуй, линия ij)2 [17], упаковывающая вирусную РНК в экотропные частицы (т. е. такие, которые способны инфицировать только клетки мыши и крысы), и линия РА 317 [32], позволяющая получать амфотропные препараты с широким кругом возможных хозяев, практически не содержащие хелперных вирусов. Известны также упаковывающие клетки для векторов на основе ретровирусов птиц [33]. [c.288]

Одной ИЗ ВОЗМОЖНЫХ причин делеций в ретровирусных геномах служит аномальный сплайсинг вирусной РНК. Хотя в MLV-векторах сигнал для упаковки расположен ниже вирусного донорного сайта сплайсинга (относительно направления транскрипции), так что молекулы, претерпевшие сплайсинг с участием именно этого сайта, неспособны упаковываться в вирусные частицы, криптические сайты сплайсинга, присутствуюш,ие во вставке, способны вызывать нежелательные последствия. Делеции и перестройки могут происходить также в результате рекомбинационных событий с участием эндогенных мышиных ретровирусных последовательностей, рекомбинации в процессе трансфекции или же ошибок при обратной- транскрипции и интеграции [14]. Кроме всего прочего в некоторых случаях делеции могут неумышленно отбираться при селекции на экспрессию определенного маркерного гена. Примером этого может служить эксперимент (табл. 9.7), демонстрирующий особенности сплайсинг-вектора для спаренных генов рМХ 1122/иг/с. пео в присутствии последовательности с-тус ингибируется сплайсинг вирусной РНК (разд. 9.7.1). Несмотря на низкую эффективность трансфекции, обнаруживаемую, этим вектором при селекции на устойчивость к G418, трансфицированные клетки активно продуцировали пео-трансдуцирующий вирус (табл. 9.7). Однако последующий анализ показал, что эти вирусные частицы несут делецию с-тус (М. Скотт, Г. Вармус, неопубликованные данные). Следовательно, селекция на эффективную экспрессию гена neo привела к утрате последовательностей с-тус, ответственных за ингибирование образования субгеномной лео-мРНК- Высокая частота делеций, обусловливающая повышенный уровень экспрессии селективного маркера, также свойственна и векторам с внутренним промотором, однако пока такие данные получены только для векторов на основе ретровирусов птиц [41]. [c.305]

Перенос генов с помощью вирусов основан на природном процессе вирусной инфекции. Эффективные векторы созданы на основе хромосомной ДНК ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса вакцины, вируса герпеса и др. Ретровирусные векторы используются особенно часто для переноса генов в клетки животных [212]. [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология