Белки разделение гидролизатов

Изучение химического строения белка начинают с определения аминокислотного состава. Для этого проводят полный кислотный гидролиз белка с последующим разделением и идентификацией аминокислот гидролизата. С развитием методов хроматографии эта задача ре-щается достаточно просто. [c.376]

Фиг. 37. Хроматографическое разделение гидролизата окисленного белка Бенс-Джонса [21].

Наиболее широкое применение электрофоретический метод получил в биохимии, в частности, для разделения сывороточных белков, гидролизатов нуклеиновых кислот, аминокислот и пептидов. Методы электрофореза подробно рассмотрены в обзорах [32— 34 , а метод электрофореза на бумаге в монографиях [3, 35, 361. [c.27]

Эфиры аминокислот представляют собою сильно основные соединения, легко растворяющиеся в органических растворителях. Многие из них перегоняются под уменьшенным давлением. Этиловые эфиры аминокислот широко используются при нсследования.х строения белков. В 1901 г. Э. Фишер предложил пользоваться фракционированной разгонкой эфиров для разделения гидролизатов аминокислот. Это был первый метод, позволивший количественно определять всю сумму аминокислот, содержащихся в белках. С помощью этого метода был открыт ряд аминокислот в белках. [c.461]

Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов совокупность различных хроматографических методов занимает центральное место. Ни один другой метод не может сравниться с хроматографией по широте количественного диапазона. Начиная от препаративных колонок объемом в несколько литров, на которых можно вести фракционирование граммовых количеств препарата на первых этапах выделения фермента, через разделение близких по своей природе компонентов очищенной смеси веществ, количество которых измеряется миллиграммами или долями миллиграмма, этот диапазон простирается до микроанализа аминокислотного состава белка, когда на колонку вносят сотые доли микрограмма исходного гидролизата. Вне конкуренции остается и разнообразие физико-химических параметров, по которым может осуществляться хроматографическое фракционирование молекулярные размеры, вторичная или третичная структура биополимеров, растворимость, адсорбционные характеристики молекул, степень их гидрофоб-ности, электрический заряд и, наконец, биологическое сродство к другим молекулам. [c.3]

Не обнаружено, однако, существенной разницы у катионитов различных марок в отношении избирательности адсорбции при разделении гидролизатов белков. Порядок появления аминокислот в фильтратах оставался тем же. Для вытеснения аминокислот применялись раствори аммиака. Хотя эти наблюдения и свидетельствуют о возможности разделений аминокислот на смолах с малой емкостью, но они, разумеется, отнюдь не позволяют сделать вывод о равноценности смол с большой и малой емкостью. Смолы с большей емкостью имеют существенные преимущества, так как уменьшают размеры установки, затрату времени и реактивов, необходимых для разделения. [c.136]

На рис. 2.14 показана хроматограмма, полученная при разделении гидролизата инсулина. Авторы работы [324] сняли полные масс-спектры всех компонентов и по характерному для каждой аминокислоты фрагменту определили изотопные отношения. Для количественного анализа они использовали целый набор внутренних стандартов. Этот метод, опробованный на примере инсулина, дает результаты, которые хорошо согласуются с известными данными о составе указанного белка и с результатами аминокислотного анализа, выполненного параллельно по традиционной схеме методом ионообменной хроматографии. [c.88]

Выделение из белковых веществ. Важнейший источник a-a шнo-кислот — природные белки. При гидролизе белков (стр. 289) образуются сложные смеси, содержащие различные аминокислоты, а также некоторые другие вещества. Трудность заключается в разделении таких смесей на составные части. Однако теперь уже существуют разнообразные методы, позволяющие выделять из белковых гидролизатов индивидуальные аминокислоты. [c.285]

Рааделение амино слот на ионообменниках основано на способности аминокислот образовывать соли с кислотами и щелочами. Подбирая соответствующие катиониты или аниониты, можно быстро и с успехом разделить гидролизат белка, пользуясь для этого 2,5—3,5 мг белка. Ионообменную хроматографию хорошо сочетать с элюционным или вытеснительным анализом. Мур и Штейн пользуются для этого катионитной смолой сульфополистирольного типа Дауэкс-50, через колонку которого пропускают аминокислоты последние вымывают затем соответствующими буферными растворами. Для разделения достаточно 3 мг аминокислот. [c.481]

Двумерное разделение пептидов, наиример гидролизатов белков, на целлюлозных н силикагелевых пластинках, где в одном (чаш е первом) направлении используется электрофорез в тонком слое (ТСЭ) при кислом pH буфера, а во втором — распределительная ТСХ. Оно применяется как для целей идентификации и сопоставления родственных белков (например, для выявления мутационных или патологических изменений), так и в качестве препаративного метода для последуюш,его анализа аминокислотной последовательности в пептидах. [c.460]

Гидролиз химотрипсином проводят при 37° С в щелочной среде (pH 8,0—8,6). Отношение фермента к белку 1 100 (по весу). При длительном гидролизе фермент к субстрату добавляют двумя или тремя порциями. Природа буфера, используемого для гидролиза, зависит от характера последующей работы. При разделении пептидов гидролизата хроматографическими и электрофоретическими методами на бу- [c.140]

Разделение смеси аминокислот. Для разделения смеси аминокислот, находящихся в гидролизате белка, и качественного обнаружения отдельных аминокислот широко используется метод распределительной хроматографии на бумаге. Этот метод представляет собой одну из модификаций метода хроматографического анализа, предложенного М. С. Цветом в 1903 г. [c.15]

Гидролиз белков ферментами пищеварительного тракта применяет-1СЯ главным образом для Проведения неполного ступенчатого расщепления. Полученный тем или иным способом гидролизат содержит смесь аминокислот и аммиак, образовавшийся в -результате расщепления аспарагина и глутамина и частичного дезаминирования пептидов и аминокислот. После предварительного удаления основной массы кислоты или щелочи гидролизат подвергают фракционному разделению на аминокислоты. В течение первых двух десятилетий текущего столетия аминокислоты разделяли в виде их эфиров, которые подвергали перегонке в вакууме (метод Э. Фишера). Позднее этот метод потерял свое значение из-за сложности выполнения и необходимости применения большого количества белка. В настоящее время благодаря появлению метода газовой хроматографии, применение эфиров аминокислот, возможно, вновь окажется интересным. [c.479]

Общая стратегия определения первичной структуры белка включает несколько этапов. Необходимо (а) провести количественный анализ гидролизата для того, чтобы определить мольное соотнощение имеющихся аминокислот (см. разд. 23.3.2) (б) определить молекулярную массу с помощью подходящего физического метода для того, чтобы вычислить количество всех присутствующих аминокислотных остатков [I—3] (в) определить количество входящих в молекулу полипептидных цепей либо с помощью хроматографического или электрофоретического разделения, либо посредством количественного анализа остатков, содержащих аминогруппу (JV-конец) и карбоксильную группу (С-конец) (см. разд. 23.3.4) [c.256]

Качественное разделение аминокислотных смесей. Разделение и идентификацию всех аминокислот в полных кислотных гидролизатах белков и пептидов нельзя провести, используя лишь один [c.100]

Анализ ферментативных гидролизатов белков. В 1957 г. Ингрэм [61 впервые показал, что двухэтапным разделением с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге можно анализировать сложные пептидные смеси, ферментативные гидролизаты и т. п. Такой анализ выявляет самые незначительные различия, с которыми можно встретиться, например, при изучении видовой специфичности или в других сравнительных исследованиях. Метод отпечатков пальцев можно назвать одним из важнейших методов современной биохимии, молекулярной биологии и иммунохимии, так как он позволяет выделить в чистом виде определенный пептид или провести микропрепаративное разделение сложной смеси. [c.103]

В последнее время метод отпечатков пальцев все чаще осуществляют в три этапа, комбинируя два электрофоретических разделения с хроматографией. Дело в том, что двухэтапный метод отпечатков пальцев не всегда дает полное разделение, особенно при анализе ферментативных гидролизатов высокомолекулярных белков, поэтому возникает необходимость дополнительного электрофоретического фракционирования (фиг. 21). [c.104]

При специфическом ферментативном гидролизе или химическом расщеплении любого белка среднего молекулярного веса получается довольно сложная смесь пептидов. Выделение и очистка всех пептидов, из которых состояла полипептидная цепь и которые содержатся в нефракционированном гидролизате, — задача достаточно трудная. Поэтому гидролизат белка рекомендуется сначала подвергнуть предварительному разделению. Среди современных методов фракционирования наиболее подходящим для этой цели является гель-фильтрация. [c.226]

Раствор сахаров, богатый ксилозой, можно получать с помощью паровой экстракции [36, 37]. По сравнительно простой технологии щепу из древесины лиственных пород, измельченное однолетнее сырье или растительные отходы обрабатывают в течение нескольких минут насыщенным паром при 180—200 С. Получающийся материал обрабатывают механически для разделения на волокна и промывают водой или разбавленной щелочью. Конечный волокнистый продукт, содержащий более /з общего лигнина, способен к дальнейшей химической или биохимической переработке. Его можно использовать в качестве грубого корма, как материал для изготовления ящичного картона и в качестве сырья для кислотного или ферментативного гидролиза. При гидролизе получаются почти исключительно глюкоза и лигнинный остаток, пригодный для переработки. В экстракте содержатся продукты гидролиза полиоз — главным образом ксилоза и фрагменты молекул ксилана. После ферментативного гидролиза в промывных водах количество ксилозы составляет до 70 %, а в щелочных экстрактах даже до 85 % (по отношению к общему количеству сахаров в гидролизатах). Из этих растворов можно выделять кристаллическую ксилозу с выходом 8 % по отношению к исходному растительному сырью. Растворы с меньшим содержанием ксилозы можно использовать в качестве субстратов для получения белка и ферментов или для производства мелассы [156]. В США в производстве картона одновременно получают 90 тыс. т/год жидкого концентрата мелассы, используемого для добавки к корму для скота [64]. [c.415]

Для электрофореза белков обычно используют пластины шириной 8—14 см и длиной (в направлении электрофореза) 8— 28 см. Электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов, например при секвенировании, нередко ведут в больших пластинах размером 33X43 см, что диктуется максимальным размером рентгеновской пленки для авторадиографии. Для разделения гидролизатов тРНК Пиртл и др. недавно использовали пластины ПААГ длиной 90 см [Р1г11е а ., 1980 . [c.26]

Еще одной важной проблемой в стереохимии природных соединений является установление строения полипептидных антибиотиков, продуцируемых бактериями и грибами. Такие полипептиды часто содержат в своей структуре неприродные аминокислоты, т. е. имеющие в-конфигурацию или обладающие структурой, не обнаруженной в белках. Очистка и установление структуры таких сложных соединений, часто вьщеляемых в очень небольших количествах, требует квалифицированного разделения и точных аналитических методов. В этом отнощении исключительно важным является непосредственное определение конфигурации аминокислот методом хиральной хроматографии. Особенно большое значение имеет применение хиральной ГХ для хирального аминокислотного анализа и создания аминокислотных карт гидролизатов. Приведенный ниже пример [24] должен проиллюстрировать сказанное. [c.182]

Обратнофазовую гидрофобную хроматографию исноль.зуют обычно для разделения относительно мелких пептидов, наиример трипсиновых гидролизатов белка. Ввиду наличия в составе пептидов как гидрофобных, так и гидрофильных аминокислотных остатков их взаимодействие с гидрофобизированной матрицей оказывается не слишком сильным, и в практике встречаются режимы хроматографической элюции, сходные с оппсапными для ФТГ-АК. [c.201]

В текущей литературе очень часто встречаются описания двумерного разделения пептидов (например, триптических гидролизатов белка) на пластинках микрогранулированной целлюлозы, где в первом направлении проводится электрофорез в кислой среде, а во [c.485]

Для разделения аминокислот (гидролизата белка) методом тонкослойной хроматографии широкое применение находят пластинки, покрытые тонким слоем ионообменной смолы полистирольной природы с сульфокислотными группировками (типа Дауэкс 50X8 ) или ионообменной целлюлозой. Такие пластинки выпускаются промышленностью, например Фиксион 50x8 (Венгрия), или могут быть приготовлены в лаборатории. В этих пластинках катионообменная смола находится в Na-форме. Пластинки стабильны в водных и органических растворителях, инертны по отношению к окислителям и восстановителям, но подвергаются воздействию щелочей и концентрированных кислот. [c.133]

Реагенты, подобные кф1цертрированным кислотам, которые неизбирательно атакуют все пептидные связи, имеют лишь ограниченное значение для расщепления полипептидов с длинной цепью, так как- состав гидролизата по мере удлинения цепи значительно усложняется. Общие вопросы гидролиза полипептидов подробно рассмотрены в обзоре Сэнджера [266]. Следует отметить, что до начала работы по разделению полученной в результате гидролиза смеси пептидов и аминокислот необходимо, чтобы продолжительность гидролиза исследуемого белка или полипептида была оптимальной. [c.177]

Разработано несколько вариантов технологического процесса, в частности, с разделением стадии микробиологического синтеза золоторастворяющих соединений и последующего выщелачивания-Экономичными растворителями можно считать гидролизаты белков, содержащие смеси аминокислот. При выщелачивании золота растворами некоторых белков можно обходиться без добавок химических окислителей. [c.154]

Реальные успехй в выяснении строения белков и их синтез были достигнуты в послевоенные годы. Это было связано прежде всего с привлечением новых физико-химических методов, в частности ультрацентрифуги Т. Сведберга, для определения молекулярных масс и в особенности хроматографии. Именно хроматографически удалось выделить в чистом виде индивидуальные вещества из гидролизатов белков, что было невозможно с помощью прежних методов разделения. [c.262]

Разделение аминокислот основано на их различной растворимости в двух несмешиваюшихся жидкостях. Одной из жидкостей служит вода, другой — насыщенный водой органический растворитель. Водная фаза неподвижна, так как фиксирована на бумаге (специально изготовляемая хроматографическая, фильтровальная бумага, будучи помещенной во влажную камеру, удерживает до 20—22% воды). Подвижной фазой могут служить различные органические растворители, насыщенные водой, например изопропиловый, изобутиловый или бутиловый спирты, фенол и др. Каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску фильтровальной бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель поднимается по полоске бумаги, растворяет нанесенные на бумагу аминокислоты и увлекает их за собой. Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от степени их раст- [c.15]

Имеется ряд детальных обзоров, охватывающих применение хроматографии для анализа аминокислот, извлеченных из белков гидролитическими методами [89, 127, 134]. Читатель может найти в этих обзорах сведения об анализе отдельных белков. Достаточно указать на то, что в настоящее время количественно наиболее точным является метод, разработанный Муром и Стейном [93]. В этом методе применен градиентный проявительный анализ на ионообменных колонках из сульфированного полистирола. На рис. 165 показан типичный пример [62] превосходного разделения, осуществленного этим методом. Если применение сложной аппаратуры нецелесообразно, то хроматография на бумаге вполне применима для анализа белковых гидролизатов [7, 10, 30, 80]. [c.336]

В гидролизатах коллагена и эластина содержатся десмозин и изодесмозин их разделяли в модифицированных условиях по одноколоночной [59, 60], а также по двухколоночной схемам анализа [61, 62]. Множество работ посвящено хроматографии серусодержащих аминокислот. Определены объемы выхода производных цистеина [63] и цистина, полученных после модификации белков и последующего гидролиза [64]. Найдены условия разделения производных лизина, полученных при модификации нативного белка, а также разработаны условия ускоренного анализа этих соединений [65, 66]. Метилгистидин и некоторые редкие аминокислоты разделяли на 15-сантиметровой колонке [67]. При снижении скорости потока в реакторе вдвое было достигнуто 10—20-кратное увеличение чувствительности при определении N-метиламинокислот, которые разделяли в специально разработанных условиях [68]. Триптофан и его производные разделяли на амберлите G-50 [69]. [c.349]

Такая система позволяет получить более четкое разделение. При нанесении образца (в объеме 40 л) элюат, не содержащий аминокислот, сливают в трап. После впитывания всех 40 л отсоединяют первую колонку и оставшиеся три промывают 0,15 н. водным раствором аммиака со скоростью 20 мл/мин, собирая элюат по фракциям объемом 250 мл. Анализ ведут методом бумажной хроматографии. Первую колонку, содержащую основные аминокислоты, соединяют с двумя небольшими колонками (2,5x20 см и 1,7x13,6 см), также заполненными полистиролом. Вытеснение ведут 0,075 н. раствором едкого натрия со скоростью подачи 6 мл/мин (объем фракций равен 250 мл). Профиль элюирования строят по данным хроматографии на бумаге. Объединяют фракции, характеризующиеся наиболее простым составом и максимальным содержанием аминокислот. Эти уже обогащенные смеси вновь фракционируют на сульфокатионите (Zeo-Karb-215) в различных условиях или на дауэксе-2 до получения чистых аминокислот. Не представляющие интереса промежуточные фракции отбрасывают. Условия рехроматографии выбирают с учетом состава смеси. Выход аминокислот составляет около 50% от веса исходного белка. В качестве источника аминокислот используют белковые гидролизаты например, яичного альбумина) или гидролизаты микроорганизмов (например, дрожжей) и даже биологические экстракты [90]. Важно лишь, чтобы смесь не содержала большого количества полисахаридов. [c.356]

Рис. 34.12. Профиль элюирования пептидов триптического гидролизата к-типа белка Бенс-Джонса Ag (первая фракция после разделения на амберлите ШС-50, см. рис. 34.11) на колонке (1,8X150 см) со смолой дауэкс 50-Х2 в пиридин-ацетатных буферах [34].

Что касается пептидов, то из входящих в их состав аминокислот наибольшее сродство к гелям сефадекса придает им триптофан. Триптофансодержащие пептиды из частичных (например, триптических) гидролизатов белков (например, цитохрома с-551 из Pseudomonas) всего сильнее удерживаются гелем и элюируются в виде отдельной зоны [123]. Классическим примером подобного явления служит разделение тироцидинов. Эта группа циклических декапептидов, обладающих антибиотической активностью, состоит из трех компонентов, один из которых (тиро- [c.191]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология