Аминокислотные анализаторы

Рис. 4.2. Хроматограммы стандартной смеси аминокислот (а) и гидро-лиаата ванадилпорфириновой фракции нефти (б), полученные на аминокислотном анализаторе — жидкостном хроматографе Mi rote hna AAA 881 [761].

Полипептиды, Понятие о пептидной связи. Проблема синтеза пептидной связи. Защита аминогруппы, методы удаления защитных групп. Определение концевых групп. Активирование карбоксильной группы для образования пептидной связи. Синтез пептидов на твердых носителях (Меррифильд). Аминокислотные анализаторы. [c.248]

Гидразиды аминокислот удаляют реакцией с бензальдегидом, изо-валериановым и другими альдегидами, а находящуюся в водной фазе С-концевую аминокислоту анализируют методами хроматографии или электрофореза на бумаге и в тонком слое или с помощью аминокислотного анализатора. Смесь, получаемую после гидразинолиза, можно обрабатывать динитрофторбензолом или дансилхлоридом. Это дает возможность идентифицировать С-концевые аминокислоты в виде ДНФ- (с. 145) или ДНС-производных (с. 148). [c.156]

Рис. 182. Принципиальная схема аминокислотного анализатора Biotronik L 7000 (см. текст)

На рис. 179 показана типичная схема расположения аминокислот на выходе аминокислотного анализатора ( hromaspek фирмы Rank Hilger ) с сохранением примерного соотношения расстояний между пиками, обозначенными вертикальными отрезками. Как видно из рисунка, пики аминокислот легко можно разбить на три группы [c.516]

Для проведения количественных определений аминокислотный анализатор должен быть откалиброван. Площади пиков обычно соотносят с пиком Lys, который менее других аминокислот разрушается прн гидролизе. Для оценки потерь материала в приборе, чувствительности окраски и регистрации используют калибровку с помощью стандартных растворов аминокислот точно известной концентрации (в отдельном опыте). Коэффициенты корреляции вводят в память интегратора (или учитывают при планиметрировании пиков). [c.527]

Рис. 181. Типичные профили хроматографической алюции аминокислот, окрашенных нингидрином, после разделения в аминокислотном анализаторе

АНАЛИЗ ПОЛИПЕПТИДОВ. Полипептиды, как и прочие амиды, можно гидролизовать водными растворами кислот или щелочей. После полного гидролиза полипептида можно при помощи аминокислотного анализатора установить его качественный и количественный аминокислотный состав, но не точную последовательность аминокислот. Если перед гидролизом обработать полипептид реактивом Сэнгера, то можно будет затем идентифицировать его N-концевую аминокислоту, так как она даст устойчивое окрашенное производное анилина, которое не разрушается при гидролизе. [c.402]

Большинство аминокислот практически не поглощает свет в доступной для регистрации области, так что их приходится окра-тпвать нпнгидрином. Этот метод окраски будет подробно рассмотрен в приложении 2, посвященном аминокислотным анализаторам. Пептиды и белки поглощают свет в области 206—215 нм за счет пептидной связи и в широкой области спектра с максимумом вбли- и1 280 нм за счет присутствия в них ароматических аминокислот. Азотистые основания и нуклеиновые кислоты хорошо поглощают вблизи 260 нм. Поэтому не удивительно, что основной метод детектирования в хроматографии белков и нуклеиновых кислот — это регистрация поглощения света в ультрафиолетовой области спектра. Соответствующие приборы мы будем для краткости именовать УФ-детекторами. [c.82]

Матрицы для ЖХВД. К их числу можно отнести особо мелкозернистые, с малым разбросом диаметров сферические ионообменники на основе полистирола (например типа Aminex ), специально разработанные для использования в аминокислотных анализаторах и жидкостных хроматографах высокого давления. Для последней цели чаще всего применяют модифицированные присадкой ионогенных групп пористые силикагели. [c.251]

ТСХ модифицированных ароматическими заместителями аминокислот в последние годы предпочитают вести на пластинках с полиамидным покрытием, поэтому из обзора Нидервизера процитируем только методы фракционирования немодифицированных аминокислот. Разумеется, ни по чувствительности и воспроизводимости результатов, ни тем более по точности количественных определений ТСХ аминокислот не может конкурировать с современными аминокислотными анализаторами. Однако существует немало ситуаций, когда возможности ТСХ оказываются вполне адекватными поставленной задаче определение аминокислотного состава, сопоставление родственных полипептидов, выявление генетических различий, проявляющихся в замене каких-либо аминокислот, клинические анализы физиологических жидкостей и др. На рис. 160 показана приведенная в цитируемом обзоре картина распределения пятен носле двумерной ТСХ модельной смеси аминокислот на иластинках с сп-ликагелевым покрытием. На старт вносили но 1 мкг каждой из ал1И-нокислот в 0,5 мкл 0,1 М раствора НС1. Элюцию в нервом направленип проводили смесью хлороформа, метанола и 17 %-ного аммиака (2 2 1), а во втором — смесью фенола и воды (3 1 но массе). [c.482]

Рассмотрение принципа действия и особенностей использования аминокислотного анализатора начнем с того, что сформулируем представления об анализируемом препарате. Для наиболее интересного случая — анализа состава белка — им является смесь 20 природных аминокислот. Все компоненты этой смеси представляют одинаковый интерес, подлежат полному разделению и количественной оценке. Интервал. молекулярных масс простирается ог 75 (Gly) до 204 (Тгр), диапазон значений р1 — от 2,97 (Glu) до 10,76 (Arg). Различия в стеиени гидрофобности тоже выражены сильно от гидрофильных дикарбоновых и оксикислот до весьма гидрофобных, несущих довольно протял<енные алифатические и ароматические боковые группы. Заметим сразу, что такие различия должны облегчить задачу хроматографического разделенпя, но вряд лн позволят обойтись без ступенчатой смены элюентов. В обычных условиях хроматографии все алшнокислоты достаточно устойчивы, но следует обратить внимание с этой точки зрения и на предшествующий хроматографии этап исчерпывающего гидролиза белков и пептидов (от него будут зависеть и результаты анализа). Агрегация аминокислот маловероятна, за исключением возможности окисления цистеинов до цистинов. Не-специфическая сорбция за счет гидрофобных взаимодействий с материалом матрицы безусловно возможна, но здесь она будет использоваться в интересах фракционирования. [c.515]

В аминокислотном анализаторе фирмы Весктап (модель 121М колонка 0,28 X 20 см смола типа Весктап АА-10 ) основную роль играет увеличение концентрации соли 1-я ступень — 0,2 н. Na-цит-рат (pH 3,28) 2-я ступень — 0,35 н. Na-цитрат (pH 3,90) 3-я ступень 1,4 н. Ма-цитрат (pH 4,95). В ходе элюцип температуру изменяют однократно (от 50 до 65"). [c.518]

В режиме, отработанно.м в Институте биоорганической химии АН СССР для аминокислотного анализатора Biotroni , Model LG 7000 (колонка 0,32 X 20 см смола ВТС 2712), эффективно используются оба фактора элюции 1-я ступень — 0,12 н. Ка-цитрат (pH 3,53) [c.518]

Фирма LKB для своего аминокислотного анализатора модели 4400 (колонка 0,4 X 27 см, смола UltroPa 8 ) рекомендует систему элюции, опирающуюся только на изменение pH элюента 1-я ступень — 0,2 н. Na-цитрат (pH 3,2) 2-я ступень — 0,2 н. Na-цитрат (pH 4,25) [c.518]

В литературе можно найти много вариантов трехступенчатых систем элюции, разработка которых стимулируется, в частности, стремлением сохранить нулевую линию регистрации при смене элюента, что улучшает надежность обсчета площади пиков на профиле элюции. Ради этого, например, недавно было предложено заменить приведенную выше стандартную схему элюции для очень популярного аминокислотного анализатора фпрмы Весктап на следующую 1-я ступень — 0,2 н. Na-цитрат (pH 3,25) 2-я ступень — 0,2 н. Na-цитрат (pH 4,25) 3-я ступень — 1,0 н. Na-цитрат (pH 7,40) [Ваг-barash, Quarles, 19821. [c.518]

Следует упомянуть, что с 1982 г. фирма Весктап начала выпуск нового поколения усовершенствованных автоматических аминокислотных анализаторов с торговым названием System 6300 . [c.518]

Для того чтобы иллюстрировать изложенный штерпал, приведем краткое описание блок-схемы одной из последних моделей аминокислотного анализатора — В1о1го1йк ЬС 7000 (рис. 182), появившегося в продаже в 1981 г. [c.520]

В приборе предусмотрен простой измеритель скорости потока жидкости 17). Он представляет собой стеклянную трубку с двумя рисками. На вход трубки подаются пузырьки воздуха, скорость перемещения которых легко подсчитать по времени прохождения известного расстояния между рисками. Манипулируя работой насосов 5) и 11), можно установить отдельно скорость элюцип колонки и скорость подачи нингидринового реактива (для указанного выше состава последнего соотношение скоростей должно быть 2 1). На выходе всего прибора имеется запорный клапан 16). Внешний вид аминокислотного анализатора Biotronik L 7000 представлен на рис. 183. Прибор можно укомплектовать интегратором с микрокомпьютером (например, типа SP4100). Он производит обсчет площади пиков и (с учетом данных по калибровке прибора стандартной смесью аминокислот) печатает на ленте аминокислотный состав исследуемого препарата. [c.522]

В полученных образцах определяют свободные аминокислоты. При тонкослойной хроматографии на пластинах Фиксион (с. 133) требуется не менее 10—30 нмоль аминокислот, для определения с помощью аминокислотного анализатора —2—5 нмоль аминокислот. Можно предварительно провести реакцию дансилирования (с. 148), а затем идентифицировать модифицированные аминокислоты с помощью тонкослойной хроматографии (в этом случае надо иметь 0,5—5 нмоль дансилированных аминокислот). При количественном определении аминокислот можно исследовать зависимость освобождения их от времени инкубации образца с карбоксипептидазой. [c.156]

Для успешной идентификации аминокислот необходимо, чтобы все они обладали характерным свойством или вступали в реакцию, продукт которой легко было бы обнаружить. Чаще всего используется способность аминокислот реагировать с нингидрином с образованием продуктов характерного синего цвета. Реакции нингидрипа с аминокислотами представлены на рис. 25-3. В настоящее Ьремя разделение и идентификация аминокислот полностью автоматизированы. Аминокислотные анализаторы позволяют провести анализ смеси аминокислот за 2—3 ч. [c.389]

А (Б. Меррифилд, 1969). Дальнейшее развитие получили аналит. методы стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич. методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в Б.-секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967) Благодаря созданию прочной методнч. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности Б. В эти годы была определена структура неск. сотен сравнительно небольших Б. (до 300 аминокислотных остатков в одной цепиХ полученных из самых разл. источников как животного, так и растит., бактериального, вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилн-зин, карбоксипептидазы), миоглобины, гемоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, Б. оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физ.-хим. биологии. [c.248]

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого Б. или пептида и количеств, определение всех аминокислот в гидролизате. Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный р-р НС1, а при анализе содержания триптофана-4 н. метансульфоновую к-ту, содержащую 0,2% ЗЧ2-аминоэтил)индола, или кипячение со щелочью. Количеств, определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по р-ции с нингидрином или флуориметрически с использованием флуоре-скамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можно анализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты. [c.250]

С переходом к ионообменной хроматографии Шпакман, Мур и Штейн смогли автоматизировать анализ [148]. Принцип работы первых автоматических аминокислотных анализаторов показан на рис. 1-14. [c.59]

Рис. 1-14. Автоматический аминокислотный анализатор по Шпакману, Муру и Штейну.

Автоматические аминокислотные анализаторы все время совершенствуются [149]. Современные чуиствнтельные автоматические анализаторы требуют для разделения белкового гидролнзата 2 — 3 ч. Цех и Вольтер предложили жидкостную хроматографическую систему под давлением это позволяет проводить анализ за 45 мни, причем предел обнаружения лежит в области пикомолей. [c.60]

Тест Фуджино [387]. Тестовая система основана на взаимодействии Bo -Ala-Met-Leu-OH с ре/и-бутиловыми эфирами лейцина, изолейцина или же с (3-/ире/и-бутиловым эфиром аспарагиновой кислоты с последующим расщеплением бромцианом и определением соотношения диастереомеров прн помощи аминокислотного анализатора [c.177]

Определение последовательности аминокислотных остатков в пептидах (Ледерер М. М. Шемякин и Н. С. Вульфсон). Благодаря широкому применению автоматических аминокислотных анализаторов определение аминокислотного состава пептидов не представляет в настоящее время значительных трудностей. Однако один из важнейших вопросов установления первичной структуры белков и пептидов — определение последовательности аминокислотных остатков в цепи продолжает оставаться весьма трудоемким и сложным. Недавно было установлено, что при масс-спектрометрировании эфиров Н-ацилированных олигопептидов в качестве первого акта фрагментации молекулярного иона происходит элиминация алкоксильной грушты и возникает линейный ион, у которого положительный заряд локализован на С-конце, а N кoнeд защищен ацильным остатком. Дальнейший распад этого иона заключается в последовательной элиминации аминокислотных остатков с перемещением положительного заряда вдоль цепи. Например, фрагментация [c.591]

Смотреть страницы где упоминается термин Аминокислотные анализаторы: [c.42] [c.244] [c.245] [c.144] [c.57] [c.68] [c.196] [c.269] [c.295] [c.296] [c.479] [c.515] [c.517] [c.520] [c.523] [c.523] [c.523] [c.524] [c.524] [c.525] [c.165] [c.56]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология