Методы окрашивания белков в гелях

Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций [1 ]. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этом увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом. [c.11]

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

Хотя концентрация белков в зонах, разделившихся при ИЭФ в геле, и достигает значительного уровня, он не всегда достаточно высок для обнаружения белков путем их осажлте-ния. Поэтому в большинстве случаев приходится прибегать к более чувствительным методам окрашивания. Для преодоления трудностей, связанных с взаимодействием красителя и амфолина, имеются два пути. Первый путь — это удаление амфолитов-носителей после фиксации, но до окрашивания белков, а второй — подбор таких условий, при которых комплексы краситель — амфолин оказываются менее прочными, чем комплексы краситель — белок. Ниже будут рассмотрены некоторые приемы, позволяющие использовать обе эти возможности. [c.154]

I. Принцип метода. Когда белки кипятят в присутствии ДСН и восстановителя (например, 2-меркаптоэтанола), они распрямляются и связывают около 1,4 г ДСН на 1 г белка. Пептидная цепочка приобретает форму жесткого эллипсоида вращения. Его малая ось имеет постоянную длину, а размер большой линейно связан с мол. массой белка. В результате связывания ДСН полипептидные цепи приобретают однородный отрицательный заряд, в результате чего отношение заряд масса у них становится постоянным. Когда в соответствии с этим зарядом они электрофоретически перемещаются в полиакриламидном геле, их подвижность обратно пропорциональна логарифму массы. Таким образом, небольшие молекулы движутся быстрее и мигрируют дальше, а более крупные перемещаются медленнее. Положение каждого из компонентов после окрашивания на белок можно сравнить с положением [c.56]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология