Очистка вирусов градиентным центрифугированием

Очистка вирусов градиентным центрифугированием [c.100]

Чтобы пометить вирусную РНК [ Н]-уридином, клетки инкубируют в течение ночи со средой без сыворотки, заражают по стандартной методике, затем добавляют 0,1 мКи/мл [ Н]-ури-дина в той же среде. Содержащую вирус среду собирают через 24 ч после заражения. Если в используемых клетках вирус размножается до высокого титра, то при очистке градиентным центрифугированием вирус, полученный, например, с одной чашки диаметром 10 см, в градиенте объемом 12 мл должен образовать видимую простым глазом зону. Если же выход вируса низок, в параллельном градиенте центрифугируют большее количество немеченого вируса и отбирают из градиента, содержащего радиоактивный материал, соответствующие фракции. Иногда раскапывают весь градиент и определяют радиоактивность в каждой фракции. [c.195]

Применяя метод осаждения на градиентную интерфазу, не всегда достигается высокая степень очистки для вируса. Поэтому после подобной процедуры проводят градиентное центрифугирование в хлористом цезии или сахарозе. [c.69]

С этой точки зрения даже наиболее высокоочищенные препараты вирусов можно рассматривать как статистически гомогенные лишь в первом приближении. Тем не менее, прежде чем использовать препарат вируса для физико-химических, биохимических или биологических экспериментов, важно установить, по возможности более тщательно, степень этой гомогенности или гетерогенности. Большинство методов очистки вирусов можно использовать также и для определения гомогенности вируса. Если при равделении в градиенте концентраций сахарозы вирус образует одну-едииственную резко ограниченную полосу, можно считать, что по седиментационным свойствам исследуемый препарат более или менее гомогенен. Однако если очистку вируса проводят только путем повторных циклов градиентного центрифугирования в растворе сахарозы, каждый раз удаляя материал, седиментирующий быстрее или медленнее, чем вирус, то в этом случае равномерность скорости седиментации уже не может служить показателем гомогенности. Иными словами, только сочетая при очистке и (или) проверке на гомогенность самые разнообразные методы, основанные на разных принципах, можно быть уверенным, что мы действительно имеем дело с каким-то определенным типом гомогенных частиц. К таким разнообразным критериям относятся константа седиментации, [c.47]

Вследствие очень высокой лабильнбсти вирусов этой группы очистку производят при помощи дифференциального и градиентного центрифугирования в сахарозе, цитрате калия или фиколле. Иногда применяют хроматографию на гидрокснлапатиге. [c.10]

В заключение следует сказать, что методы градиентного центрифугирования наиболее совершенны из всех известных в настоящее время методов очистки вирусов. Причем для некоторых вирусов достигается абсолютная очистка. Относительная сложность методов градиентного центрифугирования не препятствует его широкому распространению в препаративной биохимии вирусов. Единственным ограничением пока является то, что очи щать мoяiнo лишь сравнительно небольшие объемы вирус-содержащего материала. Поэтому для увеличения выхода очищенного вируса желательна его предварительная концентрация. Но в последнее время разрабатываются методы препаративного фракционирования в равновесном и в зональном градиенте. Для препаративных целей стали использовать угловые роторы, объем которых значительно больше объема горизонтальных [319, 324], что делают этот [c.69]

Применение градиентного центрифугирования Кроме очистки и фракционирования вирусов, метод градиентного центрифугирования можно применять для решения различных проблем. Во многих исследованиях этот метод является уникальным и почти незаменимым. Для разработки схемы эксперимента по концентрированию и очистке вируса необходимо прежде всего знание величины ила-вучей плотности. Эту величину в определенной системе градиента вследствие постоянства и воспроизводимости применяют также ддя физико-химической характеристики вирусной частицы, что помогает при классифицировании вируса. Плавучая плотность вируса служит одним из [c.73]

Метод хроматографии открыт русским ботаником М. С. Цветом еще в 1903 г. Однако широкое применение он получил лишь в тридцатые годы Усовершенствование метода привело к значительному прогрессу в препаративной и аналитической биохимии. Позже ого стали применять для очистки и фракционирования вирусов. Для этого употребляют три типа колоночной хроматографии адсорбционную ионообменную и молекулярноситевую. Хроматография менее мягкий метод очистки к фракционирования вирусов чем градиентное центрифугирование и зо-Ешльный электрофорез. [c.96]

Цикл адсорбции и элюции на эритроцитах обычно проводят перед основным этапом очистки вируса, например перед ионообменной хроматографией, гельфильтрацией ддфференциальным или градиентным центрифугированием. При комбинировании с этими методами можно добиться очень высокой степени очистки вируса, достигающей [c.107]

Осаждение на градиентную иятерфазу. Для очистки сравнительно больших количеств вируса удобно пользоваться методом осаждения на градиентную интерфазу. Принцип метода заключается в том, что в пробирку наслаивают несколько растворов различной плотности. Например, установлено, что прл зональном центрифугировании вирус локализуется в зоне 50% сахарозы. В этом случае на дно центрифужной пробирки емкостью 33 мл (ротор SW25.1) помещают 3 мл 60%-ного раствора сахарозы на трисбуфере, pH 7,4, затем осторожно наслаивают 5 мл 40%-ной сахарозы и сверху 4 мл 20%-ной сахарозы в том же буфере. На такой нреформированный ступенчатый гра- [c.68]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология