Метод градиентного центрифугирования

Метод градиентного центрифугирования [c.62]

Этот метод широко применяется для фракционирования компонентов вирусной частицы, и в особенности нуклеиновых кислот. Техника градиентного центрифугирования описана нами в разделе Градиентное центрифугирование . [c.176]

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

Очищенные методом градиентного центрифугирования вирионы (см. разд. 3.5) осаждают центрифугированием через слой 30%-ного раствора сахарозы в буфере NTE при 50 000 g 60 мин. Осадок ресуспендируют в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,2), содержащем 10% (объем на объем) тритона Х-100. [c.156]

В настоящее время существует несколько модификаций метода градиентного центрифугирования, основанного на разделении частиц по скорости седиментации или плотности в среде, где отсутствует конвекция жидкости. Они отличаются в основном в следующем в материале, применяемом для образования градиента, в способах формирования самого градиента и в скорости вращения ротора и продолжительности центрифугирования. [c.59]

Несмотря на это, все методы градиентного центрифугирования можно разделить на три группы в зависимости от используемого градиента [219] [c.59]

Градиентные приборы. Успех применения метода градиентного центрифугирования в значительной степени определяется техникой получения необходимого градиента, стабильностью образующейся системы и аккуратностью фракционирования содержимого градиентной пробирки. [c.202]

Очистку РНК можно производить различными методами, в том числе хроматографией на колонке, нротивоточным распределением и градиентным центрифугированием. [c.41]

Применяя метод осаждения на градиентную интерфазу, не всегда достигается высокая степень очистки для вируса. Поэтому после подобной процедуры проводят градиентное центрифугирование в хлористом цезии или сахарозе. [c.69]

Как было описано ранее (см. раздел Градиентное центрифугирование ), суть метода состоит в том, что при ультрацентрифугировании растворов тяжелых металлов создается градиент концентрации за счет седиментации тяжелых ионов. При этом макромолекулы за 24—26 часов под действием гравитационного поля мигрируют в те зоны пробирки, плотность которых соответствует их плавучей плотности, причем они занимают в ней весьма узкие полосы. При центрифугировании в аналитических центрифугах значение плавучей плотности для РНК, или ДНК может быть измерено с точностью до 0,001 г/см . Подобное [c.180]

Характеристика некоторых градиентных сред для выделения мембранных компонентов методом центрифугирования [c.219]

Существуют два варианта этого метода. В первом проводят зонально-скоростное центрифугирование, при этом используют градиент с небольшим диапазоном концентраций. Его функция состоит главным образом в предотвращении перемешивания фракций при центрифугировании вследствие конвекции. Нанесенный на градиентный раствор гомогенат или грубую фракцию мембран центрифугируют непродолжительное время. Частицы распределяются в соответствии со скоростями их седиментации. При достаточно большом времени центрифугирования все фракции поочередно осаждаются на дно пробирки. [c.66]

С получением таких данных стало очевидно, что можно понять природу процесса репликации, ответственного за синтез ДНК — предшественника фага, проследив за судьбой молекулы родительской ДНК, инъецированной в клетку-хозяина инфицирующим фагом. В частности, интересно было установить, действительно ли при репликации атомы родительской молекулы распределяются полуконсервативным способом, в соответствии с механизмом, постулированным Уотсоном и Криком. Первые опыты такого рода, подобно опытам при изучении бактериальной ДНК, включали метод по переносу с использованием радиоактивных изотопов или С), и они не дали определенных результатов. Однако вскоре после того, как Меселсон и Сталь исследовали распределение ДНК по плотности методом градиентного центрифугирования, этот метод стали использовать для изучения репликации ДНК Т-четных фагов. [c.268]

Как ясно видно из фиг. 177, плотность трансдуцирующих и инфекционных частиц, образовавшихся в равномерно меченной тимином легкой культуре А, не в точности совпадает и, следовательно, эти частицы можно разделить по плотности с помощью метода градиентного центрифугирования в s l. Таким образом, можно определить, какая доля частиц фага Р1 в лизате обладает трансдуцирующей активностью. Для этого ДНК бактерий-доноров метили Н, выращивая культуру на среде с Н-тими-дином. Затем культуру переносили на среду с нерадиоактивным тимиди-ном и Ф0 , так что ДНК, синтезированная после этого переноса, содержала метку Наконец, культуру заражали фагом Р1 и образовавшийся фаголизат фракционировали центрифугированием в градиенте плотности s l. Эти опыты показали, что количество меченной Н ДНК во фракции частиц, способных осуществлять трансдукцию маркера Leu+ донора, составляет 0,3% общего количества меченной Р ДНК, входящей в состав всех фаговых частиц, подвергнутых фракционированию. Следо- [c.356]

Разрушение клеток вызывает фрагментацию мембран и образование пузырьков (везикул) разного размера и плавучей плотности. Для выделения и разделения мембран ЦС используют методы дифференциального и градиентного центрифугирования и их сочетание. Метод дифференциального центрифугирования позволяет отделить мембранные пузырьки от других субклеточных структур, отличающихся по массе, следовательно, и по скорости седиментации. Таким методом можно получить тотальный препарат мембран (мнкросомную фракцию), содержащий мембраны НЦС и ЗЦС. Метод градиентного центрифугирования, позволяющий разделять структуры по плавучей плотности, используют для получения НЦС и ЗЦС. Сочетанием этих методов можно увеличить чистоту препаратов и выход материала мембран. [c.330]

В заключение следует сказать, что методы градиентного центрифугирования наиболее совершенны из всех известных в настоящее время методов очистки вирусов. Причем для некоторых вирусов достигается абсолютная очистка. Относительная сложность методов градиентного центрифугирования не препятствует его широкому распространению в препаративной биохимии вирусов. Единственным ограничением пока является то, что очи щать мoяiнo лишь сравнительно небольшие объемы вирус-содержащего материала. Поэтому для увеличения выхода очищенного вируса желательна его предварительная концентрация. Но в последнее время разрабатываются методы препаративного фракционирования в равновесном и в зональном градиенте. Для препаративных целей стали использовать угловые роторы, объем которых значительно больше объема горизонтальных [319, 324], что делают этот [c.69]

Применение градиентного центрифугирования Кроме очистки и фракционирования вирусов, метод градиентного центрифугирования можно применять для решения различных проблем. Во многих исследованиях этот метод является уникальным и почти незаменимым. Для разработки схемы эксперимента по концентрированию и очистке вируса необходимо прежде всего знание величины ила-вучей плотности. Эту величину в определенной системе градиента вследствие постоянства и воспроизводимости применяют также ддя физико-химической характеристики вирусной частицы, что помогает при классифицировании вируса. Плавучая плотность вируса служит одним из [c.73]

Разделение нативной и денатурированной ДНК осуществляется также при помощи метода противоточного распределения [8, 17] и при помощи нитроцеллюдозных мембран [18, 31]. Очистка и выделение ДНК с применением градиентного центрифугирования описаны ниже (стр. 6-5). [c.64]

Наиболее распространенным способом выделения и разделения Л. плазмы крови является метод льтра-центрифугирования в средах с определенной (однородной или градиентной) плотностью. При этом получаются фракции Л., характеризующиеся. различной плотностью и значительно отличающиеся друг от друга как по составу своих липидных компонентов, так и по характеру белковой части. Л. с высокой плотпостью (1,149) обладают электрофоретич. подвижностью ai-глобулипов, содержат 21% фосфолипидов, 57% белка, 5% триглицеридов, 17% холестерина. Л. с низкой плотностью (1,035) обладают электрофоретич. подвижностью i-глобулинов, содержат 22% фосфолипидов, 21% белка, 10% триглицеридов и 46% холестерина. В основном выделенная из плазмы крови ультрацентрифугированием фракция Л. с высокой плотностью соответствует по своим свойствам tti-Л., с низкой плотностью — i-Л. [c.488]

Более тонкие методы седиментационно-диффузионного равновесия недавно развиты Шолте [186], который применил метод концентра-ционно-градиентного центрифугирования Фуджита. Этот метод позволяет вычислить четыре средних молеку тярных веса — Ai , Мц., я т. е. МВР определяется с приемлемой степенью точности. [c.39]

С этой точки зрения даже наиболее высокоочищенные препараты вирусов можно рассматривать как статистически гомогенные лишь в первом приближении. Тем не менее, прежде чем использовать препарат вируса для физико-химических, биохимических или биологических экспериментов, важно установить, по возможности более тщательно, степень этой гомогенности или гетерогенности. Большинство методов очистки вирусов можно использовать также и для определения гомогенности вируса. Если при равделении в градиенте концентраций сахарозы вирус образует одну-едииственную резко ограниченную полосу, можно считать, что по седиментационным свойствам исследуемый препарат более или менее гомогенен. Однако если очистку вируса проводят только путем повторных циклов градиентного центрифугирования в растворе сахарозы, каждый раз удаляя материал, седиментирующий быстрее или медленнее, чем вирус, то в этом случае равномерность скорости седиментации уже не может служить показателем гомогенности. Иными словами, только сочетая при очистке и (или) проверке на гомогенность самые разнообразные методы, основанные на разных принципах, можно быть уверенным, что мы действительно имеем дело с каким-то определенным типом гомогенных частиц. К таким разнообразным критериям относятся константа седиментации, [c.47]

С помощью иммуносорбента для антигена могут решаться задачи, имеющие существенное значение для молекулярной биологии. Приведем в качестве примера выделение на иммуносорбенте типа сэндвич полирибосом, синтезирующих легкие полипептидные цепи (Е. Сидорова и др., 1978). Сорбент был нагружен антителами против легких цепей иммуноглобулинов мыши. Выделенные из клеток мышиной плазмацитомы полирибосомы для легких цепей (использовали технику градиентного центрифугирования) содержали растущие легкие цепи. Как следует из этой и других работ, растущие полипептидные цепи уже имеют, ио крайней мере, часть антигенных детерминант, характерных для данной полипептидной цепи, поэтому растущая цепь избирательно связывается с иммобилизованными антителами против этой цепи, а вместе с ней связываются с иммуносорбентом полирибосомы, содержащие мРНК для легких цепей. Теперь остается промыть иммуносорбент, путем фенольной экстракции выделить РИК и очистить мРНК общепринятым способом. Описанный принцип или аналогичные методы извлечения мРНК позволяют получить препараты определенной информационной нуклеиновой кислоты свыше 90% чистоты. [c.243]

Концентрировать многие миксовирусы при помощи сульфата аммония нельзя, так как наступает деструкция вирусной частицы. Для этой цели иногда используют метанол. Для большинства миксовирусов наиболее удобным предварительным методом концентрирования и очистки является метод адсорбции — элюции на формалинизиро-вапньтх эритроцитах или на некоторых неорганических сорбентах. Широко пснользуется дифференциальное центрифугирование. Самое широкое распространение для очистки и фракционирования миксовирусов получил метод ионообменной хроматографии. Метод равновесного центрифугирования в градиенте хлористого цезия не всегда применим при очистке некоторых миксовирусов. Поэтому используют градиентное центрифугирование в сахарозе, тартрате и цитрате калия. [c.9]

Для достижения более высокой плотности (1,32 г/мл) обычную воду заменяют тяжелой водой — Д2О (185), Тя желую воду при градиентном центрифугировании и споль-зовали Калер с сотр. [453] при исследовании вируса саркомы Рауса и Стромайер и Муссгай [775] при фракционировании инфекционной нуилеиновой кислоты вируса ящура. Но при продолжительном центрифугировании этот метод теряет свои преимущества, так как в тяжелой воде исследуемые вирусы также становятся тяжелее. Например, для вируса вакцины обмен водорода на дейтерий завершается через 20 часов. [c.70]

Метод хроматографии открыт русским ботаником М. С. Цветом еще в 1903 г. Однако широкое применение он получил лишь в тридцатые годы Усовершенствование метода привело к значительному прогрессу в препаративной и аналитической биохимии. Позже ого стали применять для очистки и фракционирования вирусов. Для этого употребляют три типа колоночной хроматографии адсорбционную ионообменную и молекулярноситевую. Хроматография менее мягкий метод очистки к фракционирования вирусов чем градиентное центрифугирование и зо-Ешльный электрофорез. [c.96]

Цикл адсорбции и элюции на эритроцитах обычно проводят перед основным этапом очистки вируса, например перед ионообменной хроматографией, гельфильтрацией ддфференциальным или градиентным центрифугированием. При комбинировании с этими методами можно добиться очень высокой степени очистки вируса, достигающей [c.107]

Плотность сухого и сырого вещества оценивают с помощью равновесного центрифугирования в градиенте плотности (разд. 5.2.3). Однако использование этого метода для клеток, а не для субклеточного материала сопряжено со скрытыми трудностями. При определении таким способом плотности сырого вещества гидратированных клеток (например, в растворах метризамида и ренографина) активность воды и осмотическая сила имеют по ходу градиента разные значения к тому же градиентный раствор может проникать в водное пространство матрикса клеточной стенки. При определении [c.237]

Для выделения различных мембранных структур из гомогената, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифугирование в градиенте плотности определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на предварительно приготовленный в центрифужной пробирке градиент плотности и центрифугируют. Градиент создается путем последовательного наслоения растворов градиентной среды уменьшающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробирке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания градиента плотности необходимо подбирать вещества в чистом состоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реагентами исследуемого раствора. Чаще всего для этого используют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чего происходит дегидратация органелл или их лизис. Кроме того, серьезным недостатком этого метода является проницаемость многих органелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и изменение эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания градиента плотности предпочитают применять другие среды фиколл, перколл и др. (табл. 16). [c.218]

Обычно применяют линейные градиенты плотности, однако в некоторых случаях в верхней части колонки целесообразно создавать также и более крутые нелинейные градиенты. Практически можно воспользоваться любым методом, предложенным для получения градиентов плотности. Наиболее простая методика, не требующая никаких специальных приборов, заключается в последовательном наслаивании нескольких растворов в порядке убывашя их плотности. Неоднородности на границах примыкающих зон позднее сглаживаются благодаря диффузии. Однако в настоящее время больщинство исследователей работают с градиентными смесителями разных типов, используемыми для создания градиентов концентрации растворов при хроматографии, центрифугировании в градиенте плотности или изо-электрическом фокусировании. Некоторые виды этих устройств и математические формулы для расчета формы кривой градиента плотности описаны Свенссоном [1259]. Приборы нескольких типов, позволяющие по желанию легко получать градиент плотности нужной формы, выпускаются промышленностью. [c.29]

Осаждение на градиентную иятерфазу. Для очистки сравнительно больших количеств вируса удобно пользоваться методом осаждения на градиентную интерфазу. Принцип метода заключается в том, что в пробирку наслаивают несколько растворов различной плотности. Например, установлено, что прл зональном центрифугировании вирус локализуется в зоне 50% сахарозы. В этом случае на дно центрифужной пробирки емкостью 33 мл (ротор SW25.1) помещают 3 мл 60%-ного раствора сахарозы на трисбуфере, pH 7,4, затем осторожно наслаивают 5 мл 40%-ной сахарозы и сверху 4 мл 20%-ной сахарозы в том же буфере. На такой нреформированный ступенчатый гра- [c.68]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология