Методы выделения и очистки вирусов

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ВИРУСОВ 33 [c.33]

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И очистки ВИРУСОВ [c.24]

В процессе очистки и выделения ферментов, гормонов и вирусов [61—68] электрофорез является наиболее полезным методом, так как он является мягким методом, который не нарушает активности и позволяет исследовать полученные фракции. [c.377]

Шведский ученый Пер-Оке Альбертсон предложил использовать для разделения бактерий, вирусов, фрагментов клеток, мембран, ядер, белков, нуклеиновых кислот и любых других частиц биологического происхождения двухфазные водные растворы полимеров — иолиэтиленгликоля, декстрана и их производных [2, 279, 280]. Фракционирование в двухфазной водной системе основывается на избирательном распределении частиц между этими фазами, аналогичном распределению растворимых веществ. Метод Альбертсона получил широкое распространение и используется во многих биохимических и микробиологических лабораториях, так как позволяет в мягких условиях, без нарушения структурной целостности и изменения нативных свойств осуществлять выделение и очистку лабильных биологических объектов, а также дать определенную информацию о их строении. Реализация этого метода в промышленном масштабе, например, для выделения вирусов или получения чистых ферментов, не встречает, по мнению автора, принципиальных трудностей, однако в очистке воды он не может быть использован. Очевидно, и любая другая модификация экстракции жидкость — жидкость неприменима при микробной очистке промышленных сточных вод и, конечно, такой метод совершенно непригоден для водоподготовки. [c.194]

Б, ОБЩИЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ ИЛИ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ [c.33]

Сделаны попытки выделения и очистки вирусов с помощью ионитов. Внедрен в производство метод деионизации и нейтрализации антитоксичных сывороток с помощью катионитов и анионитов, [c.126]

В этой главе мы изложим основные методы получения вирусных заготовок, идентификации, очистки вирусов, исследования трансформированных клеток и выделения вирусных ДНК и нуклеопротеиновых комплексов из инфицированных клеток. [c.223]

Если установлено, что защиту обеспечивает небольшой пептид (не частый случай), удобнее, возможно, получать его путем синтеза или клонирования в подходящем векторе экспрессии. Пример успешной реализации этого подхода — получение HBs-антигена, клонированного в клетках дрожжей. Изготовленная таким способом вакцина вытеснила теперь HBs-вакцину первого поколения, которую приходилось готовить трудоемким методом выделения HBs-антигена из крови носителей вируса и последующей очистки при новом способе снизилась и стоимость вакцины. [c.365]

Однако очистка большинства вирусов животных до середины 50-х годов представляла значительную проблему. Попытки применения методов белковой химии для очистки вирусов животных не принесли желаемых результатов. Поэтому вирус табачной мозаики длительное время выполнял роль основного и едва ли пе единственного объекта исследований. Потребовалось более двух десятилетий на исключительно большую теоретическую и экспериментальную работу, прежде чем были созданы современные, весьма изящные методы выделения и фракционирования биологических макромолекул, в том числе и вирусов. [c.42]

Мембранные фильтры используют для анализа воды и очистки ее от микроорганизмов, выделения и концентрирования специфической микрофлоры, в том числе и вирусов, медицинских и клинических анализов, анализа воздуха и др. Исследования последних лет [369] показали, что метод ультрафильтрования непригоден для концентрирования бактерий из воды с целью последующего изучения их физиологических и биохимических свойств, так как последние изменяются в процессе фильтрования. Кроме того, значительное количество микроорганизмов связывается с мембранами. Следовательно, после концентрирования с помощью ультрафильтрования микроорганизмы ни количественно, ни функционально не эквивалентны тем, которые обитают в воде. Мембранные фильтры применяются также в промышленности, где существует острая необходимость бактериально чистой воды, главным образом в медицинской и пищевой [365, [c.197]

НОЙ концентрации соли, и поэтому некоторые методы очистки для работы с такими вирусами непригодны. Под влиянием крайних значений pH и высоких температур разрушаются все вирусы, но при этом они сильно различаются между собой по стабильности в различных пределах значений pH и по чувствительности к температуре. Примером может служить, с одной стороны, высокая чувствительность к низким pH вируса ящура, который теряет свою инфекционность при pH ниже 6,5. С другой стороны, вирус мозаики костра разбухает при нейтральных pH и устойчив только при pH 4—6. Таким образом, при выделении вирусов часто можно подобрать такие условия pH и температуры, которые, оказывая неблагоприятное и денатурирующее воздействие на примеси, не влияют на выделяемый вирус. [c.34]

Выше отмечалось, что обнаружение энтеровирусов во внешней среде, в частности в воде, связано со значительными трудностями, что обусловлено малой концентрацией вирусов в воде и губительным влиянием на них условий выделения. В то же время изучение роли воды в распространении вирусных заболеваний, поиски оптимальных решений технологических схем очистки и обеззараживания воды неизбежно сталкиваются с практически ограниченными возможностями методов изоляции вирусов. Необходимы чувствительные методы точного количественного и качественного определения вирусов в воде. [c.67]

В следующих разделах описана в общих чертах теория каждого метода центрифугирования, а также следующие аппараты 1) низкоскоростная ультрацентрифуга, применяемая для определения кривых распределения коллоидных частиц, 2) высокоскоростная ультрацентрифуга с масляной иди воздушной турбиной для определения констант седиментации органических макромолекул, 3) равновесная ультрацентрифуга, применяемая для соединений с молекулярным весом порядка нескольких тысяч, и 4) препаративная воздушная центрифуга для выделения и очистки таких высокомолекулярных веществ, как вирусы. Для каждого аппарата описана методика проведения измерений, а также специальные области применения и примеры проведенных исследований. [c.463]

Для очистки вирусов используют общие методы выделения белков. Методы отделения вирусов от клеточных белков основаны, во-первых, на том, что вирусы по своей природе представляют собой обособленные частицы, а во-вторых,— на более высокой плавучей плотности вирусных частиц, обусловленной присутствием в них нуклеиновой кислоты. Однако для отделения вирусов от нуклеопротеидных частиц самой клетки, имеющих такой же состав и размеры, как и вирусная частица, требуются специальные методы. [c.33]

Для очистки выделенных штаммов вирусов от материалов клеток хозяина используют чаще других методов адсорбцию на фор-малинизироваиных куриных эритроцитах с последующим элюированием физиологическим раствором хлористого натрия [1] и метод дифференциального центрифугирования при низких и высоких скоростях вращения [2]. Однако оба метода трудоемки и не обеспечивают ПОЛНО очнст1- и вируса от сонутству ощнх веществ. [c.80]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Книга принадлежит перу одного из создателей современной вирусологии. Чрезвычайно сжато, но вместе с тем очень шиво и интересно автор рассматривает на основе новейших данных все аспекты науки о вирусах методы выделения и очистки вирусов и их отдельных компонентов, свойства вирусных белков и нуклеиновых кислот, связь структуры вирусных частиц и их функций, природу инфекционности вирусов, их биологию и классификацию и т. д. Книга очень хорошо иллюстрирована многочисленными микрофотографиями, схемами и графиками. [c.4]

Но в книге X. Френкель-Конрата нас привлекла прежде всего ясность, оригинальность и свежесть изложения тех вопросов, которым уделено сравнительно мало места в большинстве других, близких по теме монографий. Это вопросы выявления, выделения и очистки вирусов, химического состава и структуры целых вирионов и их компонентов, взаимного расположения этих компонентов (гл. II—VIII), а также сборки и искусственного воссоздания вирусов (гл. X). Эти главы, которые составляют большую часть книги и материал которых наиболее близок личным научным интересам автора, являются, несмотря на компактность изложения, прекрасным и почти исчерпывающим введением в общую и структурную химию вирусов. Они дают полное представление не только о составе вирусных частиц, но и о современных методах их химического, биохимического и физико-химического исследования. Многочисленные указания на возможные методические ошибки и практику проведения экспериментов делают книгу особенно ценной для начинающих научных работников. [c.6]

Применяя ряд коллодийных мембран с градуированной по Илфорду и все уменьшающейся пористостью, Грабар измерял наименьший размер пор, при котором через мембрану в процессе ультрафильтрацни проходил раствор белков- или вирусов, и определял таким путем их размеры. Этот метод применялся для выделения и изучения размеров ряда вирусов. Использование диализа и ультрафильтрации для очистки коллоидных систем описывалось во второй главе. [c.215]

Оптимальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из донорного штамма или трансфецирующей ДНК бактериального вируса часто зависит от особенностей соответствующих бактерий ил1/ вирусов. Общие принципы и методы разрушения клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий с целью выделения ДНК приведены в гл. 22. Чаще других для выделения и очистки высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов применяется метод, описанный Мармуром [29]. Он подробно изложен в разд. 22.2.1. Однако в большинстве случаев использование высокоочищенных препаратов ДНК, не содержащих РНК и другие примеси, необязательно поэтому можно обойтись без обработки рибонуклеазой. Специальные методы выделения ДНК плазмид описаны в гл. 15. [c.67]

Вирусы гриппа — это содержащие однонитевую РНК оболочечные вирусы, вызывающие серьезные эпидемические заболевания человека и многих видов животных, в частности лошадей, свиней, тюленей и домашней птицы. Известны три типа данных вирусов, выделенные на основании различий между нуклеокап-сидами в реакции связывания комплемента они отличаются также по биохимическим и биологическим свойствам. Вирусы типа А, способные к быстрым и резким изменениям антигенных свойств (антигенный дрейф), являются главной причиной пандемий гриппа человека поэтому они исследованы наиболее подробно. Большинство методов выращивания, очистки и титрования вирусов гриппа разработаны именно для вирусов этого типа. Вирусы типа В, хотя и не способны к антигенному дрейфу, по всем остальным биохимическим и биологическим свойствам очень близки к вирусам типа А поэтому их, как правило, можно выращивать и титровать, пользуясь теми же методами. С другой стороны, вирусы типа С по своим биохимическим свойствам весьма далеки от вирусов типов А и В соответственно они имеют и другие ростовые свойства. Поскольку вирусы этого типа изучены намного хуже, чем другие, в настоящей главе основное внимание уделено методам, разработанным для вирусов типов А и В, в особенности тем, с которыми авторы знакомы по собственному опыту. Тем не менее большинство этих методов применимы и к вирусам типа С. Данная глава представляет собой практическое руководство, и соответственно теоретические основы методов, как правило, не рассматриваются. При необходимости упоминаются некоторые биологические особенности вирусов и даются ссылки на соответствующую литературу однако полное описание этих свойств можно найти в недавно опубликованных подробных обзорах [1—3]. [c.161]

Методы выделения вирусов простого герпеса довольно сложны по сравнению с другими вирусами. Более того, метод, хорошо зарекомендовавший себя при работе с одним штаммом вируса на определенной клеточной линии, может оказаться неприемлемым для других штаммов на той же линии или того же штамма вируса на других клетках. Поэтому мы опишем два метода. Мы показали, что первый метод можно успешно применять для получения штамма HFEM и некоторых других при условии, что для выращивания вируса используют клетки Нер-2. Данный метод прост и позволяет получать вирусные препараты высокой степени чистоты. Второй метод позволяет достигнуть удовлетворительных результатов со всеми штаммами вируса и различными типами клеток. Для выбора оптимальных условий получения высокого выхода вируса и качественного исходного материала для дальнейшей очистки следует вначале изучить кривую роста исследуемого вирусного штамма на различных линиях клеток. На рис. 10.4 показана кривая роста штамма HFEM на клетках Нер-2 при высокой множественности инфекции и культивировании клеток при 32 °С. Оптимальные условия, которые требуются для приготовления исходного материала, в общих чертах описаны в разд. 2.5.1. [c.279]

Так, В. Р. Обухова и Л. Б, Меклер [69] разработали в 1964 г. простой и эффективный метод очистки и концентрирования вирусов при помощи ультрафильтра, импрегниро ванного агаром. В 1967 г для этих целей Уоллис и Мельник [827] применили мембранные миллипоровые фильтры. Этот метод успешно применяется для концентрирования и выделения ряда вирусов из очень разбавленных растворов (сточные воды) с целью индикации вирусов в объектах внешней среды. [c.43]

Метод адсорбции-элюции на эритроцитах также используют для фракционирования и выделения структурных компонентов миксовирусов [506]. Так, Ротт с сотр. (695) применял этот метод не только для очистки вируса, но и для выделения и очистки неинфекционных гемагглютинин рующих частиц [c.107]

Начиная с классических исследований Стэнли, Боудэна, Пири и других в 1930-х годах, много усилий было направлено на разработку методов выделепия и очистки вирусов растений. Чтобы изучить основные свойства вируса, необходимо уметь получать препараты, более или менее свободные от компонентов клетки-хозяина, но сохраняюп1 ие, одиако, при этом инфекционность. Не удивительно поэтому, что первыми выделенными и эффективно изученными вирусами бы,пи те, которые достаточно стабильны и содержатся в растении-хозяине в относительно высокой концентрации (ВТМ, Х-вирус картофеля и вирус кустистой карликовости томатов). В настояш ее время круг такого рода вопросов расширился и возник интерес к ряду вирусов, сильно различающихся по своей концентрации в растении-хозяине, а также по устойчивости к различным физическим и химическим воздействиям. В этом случае нет общепринятых правил методы, эффективные в отношении одного вируса, могут быть совершенно неприменимы к другому, по всей вероятности, сходному вирусу. Даже разные штаммы одного и того же вируса могут требовать для успешного выделения применения различных методов. [c.36]

Применеиие. Ж х важнейший физ -хим метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов белков ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых к-т, углеводов, липидов, гормонов и т д, изучения процессов метаболизма в живых организмах лек препаратов, диагностики в медицине, анализа продуктов хим и нефтехим синтеза попупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод, изучения изотерм сорбции из р-ра, кинетики и селективности хим [c.153]

При групповом разделении методом гель-фильтрации удается в значительной мере избежать разбавления, если учитывать объемные соотношения, подробно рассмотренные в разделе Обессоливание . При очистке суспензии вируса (выделенного из столовой свеклы) от сопутствующих пигментов путем гель-фильтрации на 4—6-кратном (по отнощению к объему образца) объеме сефадекса 0-75 разделение составляло лишь 20—30% [14]. Свободные от белков катехоламины — адреналин и норадреналин — были выделены без разбавления из 20 мл сыворотки (27% объема колонки) гель-фильтрацией на сефадексе 0-25 (2X25 сж, 78 мл) [15]. Кислюк [16] показал, что с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 удается гораздо легче отделить фермент от его кофакторов, чем с помощью диализа. Таким путем удается получить кофакторы в сравнительно небольшом объеме и изучить эффект их вторичного присоединения к ферменту. После гель-фильтрации был выделен совершенно неактивный белок, активность которого вновь восстанавливалась (до 86% исходной) после добавления низкомолекулярной фракции. При диализе активность фермента снижалась только до 38% [16]. Групповое разделение гель-фильтрацией оказалось чрезвычайно удобным методом отделения низкомолекулярных антигенов от антител. Диссоциацию комплекса антиген — антитело часто осуществляют, добавляя избыток гаптена, который затем можно легко отделить от белка гель-фильтрацией [17]. В бактериологии гель-фильтрация на сефадексе 0-75 или биогеле Р-100 может служить для удобного выделения экстрацеллюлярных токсинов. Перед засевом культуральную среду освобождают от высокомолекулярных примесей гель-фильтрацией. Затем на той же колонке после удаления бактерий можно вновь отделить высокомолекулярные токсины от культуральной среды [18]. [c.142]

Книга, посвященная мембранным методам разделения ясидких систем, выходит в нашей стране впервые. В ней излагаются основы теории обратного осмоса, ультрафиль-гсрации в испарения через мембрану. Рассматривается практическое применение этих методов в химической, нефтеперерабатывающей и нефтехимической, пищевой, медицинской, микробиологической и других отраслях промышленности для разделения и концентрирования растворов, очистки промышленных стоков, опреснения морских и солоноватых вод, разделения азеотропных, близкокипящих ж нетермостойких смесей, смещения равновесия в химических реакторах, обезвоживания фруктовых и овощвых соков, молока при производстве и выделении биологически активных веществ, вакцин, вирусов, ферментов и т. д. [c.2]

Получение ультрафиолетовых спектров поглощения вирусов — метод в наши дни весьма доступный, так как регистрирующие спектрофотометры имеются сейчас почти во всех лабораториях. Для регистрации спектра требуется всего лишь 0,05—0,2 мг вируса, причем материал этот может быть использован повторно. По характеру кривой поглощения можно судить о содержании в вирусе белков и нуклеиновых кислот. Отношение величины поглощения при 260 и 280 нм ( 260/ 280)1 а также отношение ыакс/ мин характеризует относительное содержание нуклеиновых кислот и белков в пробе, а отсутствие изменений в характере спектра после дальнейшей очистки и фракционирования препаратов вируса служит дополнительным указанием на чистоту выделенного вируса (см. гл. IV, разд. В). [c.48]

К числу наиболее распространенных процессов водоподготовки относится удаление взвешенных и коллоидных примесей воды. В соответствии с принципом классификации примесей воды, разработанным в Институте коллоидной химии и химии воды АН УССР, для удаления разнообразных загрязнений часто оказывается рациональным использовать приемы и способы, позволяющие трансформировать эти вещества в коллоидное или взвешенное состояние с последующим выделением их методами, характерными для гетерогенных примесей. Даже такие виды загрязнений, для которых уже сложились традиционные методы очистки, могут быть удалены более эффективно, если нх перевести в другое фазово-дисперсное состояние. Речь идет, в частности, об устойчивых формах болезнетворных организмов, а именно, о вирусах, споровых формах бактерий, тем более, что обычно применяемые способы обеззараживания воды (воздействие окислителей, излучений, ионов тяжелых металлов и др.) по отношению к ним недостаточно эффективны. [c.3]

Демонстрация ключевой роли сиаловой кислоты как компонента многих гликонротеинов в их отношении к частице вируса гриппа и к вирусной инфекции (обзор см. [186]) имела большое влияние на современные исследования гликонротеинов. Можно отметить лишь немногие направления в современном развитии исследований. Многие уже известные и очищенные гликонротеины, включая групповые вещества крови и белки сыворотки, были исследованы вновь и вскоре стала очевидной широкая распространенность гликонротеинов, содержащих сиаловые кислоты. Присутствие сиаловой кислоты во многих гликопротеинах, представляющих биологический интерес, делает необходимым развитие мягких методов их выделения и очистки, поскольку кетозидная связь, соединяющая концевой остаток сиаловой кислоты с ее партнером, чувствительна даже к 0,05 п. минеральной кислоте. Ферментативное отщепление сиаловой кислоты от гликонротеинов позволило оценить ее вклад в физические, химические и биологические свойства индивидуальных гликопротеинов. Этот подход был очень плодотворным. Так, оказалось, что сиаловая кислота ответственна за низкую изоэлектрическую точку и высокую электрофоретическую подвин ность сиалогликопротеинов, за электрофоретическую подвижность эритроцитов и раковых клеток, за вязкость гликонротеинов слюны, за биологическую активность гонадотропинов и других гормонов и за правильное функционирование фактора Кэстла. По счастливому стечению обстоятельств этот рост исследований гликонротеинов происходил в то время, когда был доступен арсенал чувствительных, мощных и специфических методов исследования состава и структуры сложных белков и определения их физических свойств и химической реакционной способности. Ниже будут рассмотрены успехи, достигнутые к настоящему времени. [c.23]

Электрофорез окажется, повидимому, наиболее полезным в области биохимии в качестве метода очистки белков, антител, ферментов, гормонов, вирусов и т. п. При изучении антител, концентрация которых допускает их наблюдение на диаграммах, можно установить расположение и концентрацию антител путем сравнения изображений, полученных до и после осаждения антител специфическими антигенами. Этот случай изучали ва гиперим-мунной лошадиной и кроличьей сыворотках [55—57]. Однако в большинстве случаев концентрация антител лежит ниже предела чувствительности прибора. В таких случаях необходимо прибегать к исследованию выделенных проб (см. стр. 360) при помощи методов дополнительной фиксации, агглютинации, нейтрализации и т. п. [58—60]. [c.377]

На протяжении почти всего периода меяеду 1900 и 1935 гг. внимание исследователей было сосредоточено на описании как макроскопических симптомов болезней, так и цитологических нарушений, обнаруживаемых с помощью светового микроскопа. Проводилось таюте изучение спектра растений-хозяев и способов передачи болезнетворных агентов. Были предприняты довольно безуспешные попытки улучшить методы фильтрации, чтобы иметь возмояшость более точно определить размеры вирусных частиц. Это были почти единственные аспекты проблемы вирусных инфекций, которые молено было изучать с помощью существовавших в то время методов. Проводилось также исследование влияния различных физических и химических факторов на инфекционность вирусов, но методы тестирования инфекционного материала были примитивными. Холмс [814] показал, что местные поражения, возникающие у некоторых растений-хозяев в результате механической инокуляции, могут быть использованы для быстрого количественного определения инфекционности вируса. Этот способ значительно облегчил изучение свойств вирусов и явился основой методов их выделения и очистки, появивпшхся несколько лет спустя. [c.10]