Зональное центрифугирование

Для выделения ферментов из материалов различного происхождения, их фракционирования и концентрирования разработано множество эффективных методов. К ним относятся кристаллизация [5—7], диализ, ультрафильтрация и концентрирование на полых волокнах (8—10], электрофорез [И—13, гл. 35], экстракция [14, 15], лиофилизация [16], преципитация и методы с использованием растворимых неионных полимеров [17, 18], зональное центрифугирование [19]. [c.9]

Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса [13]. [c.148]

Таблица 1.2. Зональное центрифугирование в градиентах концентрации сахарозы

Выделение субклеточных частиц Дифференциальное центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности, зональное центрифугирование 9, 10 [c.66]

Седиментационные характеристики частиц, содержащихся в вирусных препаратах, можно исследовать либо методом зонального центрифугирования в градиентах концентрации сахарозы, либо методом аналитического ультрацентрифугирования. [c.24]

А. Определение s методом зонального центрифугирования [c.67]

Синхронность культуры поддерживается в течение двух или трех циклов деления клеток в случае более длительного периода синхронность приходится устанавливать заново с помощью описанного выше метода. Проточное зональное центрифугирование в градиенте плотности позволяет получать большие количества инокулята для синхронизованного культивирования микроорганизмов. Оно представляется перспективным в обеспечении непрерывной синхронизации с помощью рассчитанной во времени инокуляции турбидиметрически регулируемой проточной культуры (турбидостат). На рис. 10.8 показана типичная кривая роста синхронизованной популяции бактерий видно, что после двух циклов кривая начинает выравниваться. [c.417]

В роторах с подвесными стаканами (фиг. 38, В) конвекционные явления выражены в меньшей степени, чем в угловых роторах. Такие роторы также очень широко применяются для зонального центрифугирования. Более того, некоторое время назад для зональных опытов использовались роторы только такого типа впоследствии [c.184]

Роторы с 4 и 6 подвесными стаканами, оптимальное разрешение, разделение более широких пиков при скоростном зональном центрифугировании [c.192]

Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем) большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100000 д в течение 1—4 ч. [c.149]

Чаще всего для разделения мембран применяют метод центрифугирования. Мембранные частицы разделяют по скорости их седиментации (зональное центрифугирование) или по плавучей [c.217]

ЗОНАЛЬНОЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СИСТЕМ [c.248]

Метод зонального центрифугирования свободен от обоих указанных недостатков. Раствор макромолекул наносят тонким слоем на поверхность растворителя, занимающего [c.248]

Отметим одно из главных достоинств метода зонального центрифугирования. Оно заключается в том, что весь исследуемый биологический материал сконцентрирован в не- [c.249]

Препаративное зональное центрифугирование применяют в основном как метод очистки. При этом пользуются заранее сформированным градиентом концентрации относи- [c.250]

Вирионы рабдовирусов имеют весьма характерную структуру в препаратах, окрашенных методом негативного контрастирования, обнаруживаются частицы вариабельной длины, имеющие закругленный и уплощенный концы (так называемые пулевидные частицы). Нормальные инфекционные вирионы имеют длину 170—180 нм и диаметр 70 нм. Дефектные интерферирующие частицы (ДИЧ) сохраняют характерную для инфекционных частиц пулевидную форму, но имеют меньшую длину. Они неинфекционны и накапливаются в возрастающем количестве при пассировании большинства типичных рабдовирусов без разведения благодаря их способности успешно конкурировать (интерферировать) с нормальными инфекционными частицами. ДИЧ имеют такой же химический состав, как и стандартные вирионы, но их геномная РНК имеет меньший размер. ДИЧ и стандартные вирионы данного вируса существенно различаются по коэффициентам седиментации, что используется для их разделения методом зонального центрифугирования. Метод, описанный ниже, эффективен для очистки вируса из культуральной среды. Хотя рабдовирусы высвобождаются из зара- [c.123]

При очистке этим методом сконцентрированный вирус сначала подвергают зональному центрифугированию в 15— 60%-ном (вес на объем) градиенте концентрации сахарозы в NTE. [c.186]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

При описанном выше ультрацентрифугировании пики, наблюдаемые при помощи шлирен-системы, отвечают границам между раствором и растворителем. Первые, быстрые пики отвечают компонентам, движущимся в окружении более медленных компонентов (фиг. 8). В биохимических смесях некоторые из этих медленных компонентов (например, рибосомы при анализе бактериального экстракта) создают большую вязкость. Измеряемые коэффициенты седиментации могут при этом очень сильно отличаться от приведенного к стандартным условиям значения Поэтому полученные при помощи скоростной седиментации значения s не всегда можно непосредственно использовать при планировании и анализе данных препаративного зонального центрифугирования в градиентах плотности. При зональном ультрацентрифугировании анализируемая смесь наносится в виде слоя на раствор с увеличивающейся по направлению ко дну плотностью (что предотвращает конвекционное перемешивание) и различные компоненты седиментируют в градиенте плотности в виде отдельных зон. Для наслоения смеси можно использовать специальную аналитическую ячейку, в которой техника наслоения принципиально не отличается от обычного препаративного наслоения на градиент. Одна из таких ячеек (Be kman Instruments In .) приведена на фиг. 15. Преимущества применения такой ячейки, как отмечают Виноград и Брунер [11], состоят в том, что она требует меньше исследуемого материала, анализируемые компоненты в ней пространственно разобщены, медленные примеси отстают от быстрее движущихся зон и седиментацию последних можно осуществлять в любом растворителе, не прибегая к предварительному диализу. Растворитель должен быть более плотным по сравнению с [c.67]

Значения параметра к (и fe) для скоростного зонального центрифугирования, вычисленные для сахарозного градиента 5—20% при 5 °С (данные фирмы Be kman Instruments In .) [c.197]

Точно так же, как для оценки времени осаждения в ультрацентрифуге компонента с данным ко фициентом седиментации s используются параметры ST, Pi или k, можно предложить аналогичный параметр к для зонального центрифугирования в градиенте плотности. В табл. 7 (данные фирмы Be kman Instruments In .) приведены значения этого параметра для различных роторов, выпускаемых этой фирмой. С помощью фактора к можно определить время, необходимое для седиментации частиц с данным коэффициентом седиментации и данной плотностью в градиенте плотности от мениска до дна пробирки. В таблице приведены девять значений этого фактора для различных роторов и для частиц с плотностями от 1,1 до 1,9 г/мл, седиментирующих в линейном градиенте сахарозы (5—20% по массе) при 5°С. [c.198]

Дальнейщую очистку вируса проводят повторным центрифугированием в градиенте. Применяют либо зональное центрифугирование в 15—60%-НОМ градиенте концентрации сахарозы, либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в 20—45%-НОМ (вес на объем) градиенте плотности тартрата калия. [c.186]

Зависимость константы седиментации от скорости вращения ротора. Уже при первых попытках использовать метод седиментации границы раздела ддя исследования образцов ДНК с молекулярным весом выше 30 ООО ООО были отмечены аномалии, связанные со скоростью вращения ротора [75, 76]. В настоящее время артефакты скорости достаточно подробно изучены данные самого последнего времени свидетельствуют в пользу того, что эти артефакты возникают в результате конвекции и обратимого образования межмолекуляриых агрегатов [44, 46]. На практике этих артефактов можно избежать, если работать при скорости вращения ротора ниже 15 ООО об мин и концентрациях ниже 20 мкг мл. Используя ЭТИ предосторожности, различные авторы получили хорошо совпадающие значения констант седиментации для самых высокомолекулярных из изученных ДНК, а именно для ДНК Т-четных фагов [26, 45, 46]. При использовании обоих методов зонального центрифугирования артефакты скорости отмечены не были. [c.224]

Выбор метода зависит от цели эксперимента. В ряде случаев бывает целесообразно проводить начальную стадию эксперимента (например, мечение изотопами) на несинхроннзированной, экспоненциально растущей культуре и затем отбирать для ферментативного анализа клетки на определенной фазе клеточного цикла, используя, например, зональное центрифугирование. В экспериментах такого рода отобранные клетки, как правило, далее не культивируются, так что их можно подвергать различным повреждающим воздействиям окружающей среды. [c.146]

Для выделения различных мембранных структур из гомогената, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифугирование в градиенте плотности определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на предварительно приготовленный в центрифужной пробирке градиент плотности и центрифугируют. Градиент создается путем последовательного наслоения растворов градиентной среды уменьшающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробирке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания градиента плотности необходимо подбирать вещества в чистом состоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реагентами исследуемого раствора. Чаще всего для этого используют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чего происходит дегидратация органелл или их лизис. Кроме того, серьезным недостатком этого метода является проницаемость многих органелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и изменение эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания градиента плотности предпочитают применять другие среды фиколл, перколл и др. (табл. 16). [c.218]

Эти проблемы можно свести к минимуму при зональном электрофорезе, где (как и в методе зонального центрифугирования) макромолекулы присутствуют вначале лищь в очень тонком слое. Конвекцию можно подавить с помощью градиента плотности, но гораздо большее распространение получил электрофорез в твердотельном носителе, насыщенном буфером. Некоторые носители лишь слабо или неспецифически реагируют с ма-кромолекулярными компонентами раствора к ним относятся бумага, целлюлоза для тонкослойной хроматографии и ацетат целлюлозы. В других материалах при движении молекул происходит отставание молекул одних типов от молекул других типов к ним относятся полиакриламидные и агарозные гели (в которых происходит сортировка молекул по размерам) и бумажные ионообменники (в которых осуществляется избирательная задержка заряженных молекул). [c.302]

Кольцевую ДНК другого рода впервые обнаружили у бактериофага X. При исследовании ДНК фага X на ультрацентрифуге оказалось, что она представлена набором компонентов с различными коэффициентами седиментации. Если вьщелить один из компонентов при помоши зонального центрифугирования и оставить его в покое на некоторое время, он медленно перейдет в равновесную смесь компонентов. Использование ферментов, а также исследования с помощью электронного микроскопа показали, что два наиболее медленно седиментирующие компонента, 21S- и 245-компоненты, представляют собой соответственно двухцепочечную линейную и двухцепочечную кольцевую формы молекулы. Более быстрые компоненты являются /i-мерами этих последних, например линейными или кольцевыми лвухцепочечными молекулами двойной длины. Чтобы объяснить способность ДНК фага X претерпевать все эти взаимные превращения, было высказано [c.383]

Зональное центрифугирование лучше всего проводить в бакет-роторах или вертикальных роторах, чтобы избежать нежелательного взаимодействия материала со стенками пробирки. Линейные градиенты сахарозы (5—20%, вес на вес) готовят одним из стандартных методов (см. гл. 1, разд. 2.5.1) и сверху осторожно наслаивают раствор вируса. Поскольку при использовании данного метода отсутствует эффект концентрирования в результате образования зоны с соответствующей плавучей плотностью, объем образца не должен превышать 1/10 объема градиента. Центрифугирование следует проводить при 4°С. Время и скорость центрифугирования во многом зависят от геометрии используемого ротора, поэтому можно дать лишь самые приблизительные указания относительно режима. Первоначально используемый режим центрифугирования обычно приходится модифицировать после первых опытов с учетом полученных результатов. В бакет-роторе, например SW27, центрифугирование в течение 2 ч при 27 ООО об/мин позволяет получить достаточную степень очистки большинства тогавирусов. [c.101]

Получение вирусов из фракций градиентов. На последней стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее градиент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести содержащие вирус фракции равным объемом буферного раствора, чтобы материал можно было непосредственно наносить на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зонального центрифугирования объем образца должен быть небольшим, разведение фракций предыдущего градиента в этом случае, как правило, невозможно поэтому предпочтительно проводить зональное центрифугирование перед изопикническим, если используемая схема очистки включает оба варианта центрифугирования. Полного удаления вещества, образующего градиент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультрацентрифугированием. Диализ очищенного материала проводят в нескольких сменах подходящего буферного раствора (например, GTNE, хотя в некоторых случаях для последующего использования очищенного вируса может потребоваться другой буфер). Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская через нее пятикратный по отношению к образцу объем того буферного раствора, в котором должен быть растворен очищенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или [c.103]

Рис. 6.4. Электронные микрофотографии очищенных вирионов вируса гриппаА. Вирус был очищен зональным центрифугированием, как описано в разд. 4.3.3. Препарат был негативно контрастирован фосфорно-вольфрамовой кислотой и смешан с суспензией латексных частиц. Концентрация частиц известна, они видны на рис. 6.4, а. Средний диаметр вирусных частиц 100 нм. Они имеют четко выраженные выросты (шипы), образованные гемагглютинином и нейраминидазой. Шипы лучше видны на микрофотографии 6.4, б, сделанной с большим увеличением. Отрезок на обеих микрофотографиях соответствует 100 нм

Справочник химика 21

Химия и химическая технология