Денатурирующие гели с формамидом

Денатурирующие гели с формамидом [c.135]

Другим эффективным денатурирующим агентом является деионизованный формамид. Если РНК, растворенные в 98%-ном формамиде, подвергнуть электрофорезу в низкопроцентных полиакриламидных гелях, также содержащих 98%-ный формамид, то подвижность РНК будет определяться размерами их молекул [89, 90]. С помощью этого метода было осуществлено как аналитическое, так и препаративное разделение многих матричных и рибосомальных РНК [78] (рис. 10.7). [c.179]

Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Сначала смесь фрагментов ДНК разделяют в соответствии с их размерами с помощью обычного гель-электрофореза, а затем в перпендикулярном направлении проводят электрофорез в 4%-ном полиакриламидном геле в градиенте концентрации формамида (от 4 до 30%) и мочевины (от 0,7 до 5,25 М). Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. Связь между подвижностью фрагментов ДНК и их нуклеотидной последовательностью носит сложный характер и до сих пор окончательно не выяснена [115], [c.185]

Разработанный Лерманом и Фишером метод электрофоретического разделения близких последовательностей ДНК основан на использовании различий в температуре плавления, обусловленных нуклеотидными заменами [27, 28]. Они исходят из того факта, что последовательность оснований влияет на Гт области плавления и что конформация фрагмента ДНК обусловливает его подвижность в геле под действием электрического поля. Принцип метода — электрофорез ДНК в акриламидном геле фиксированной концентрации с линейно возрастающим к нижней части геля градиентом концентрации веществ, денатурирующих ДНК обычно мочевины или формамида (рис. 3, ). Электрофорезная камера нагревается до температуры примерно 60°С. [c.129]

В отличие от мочевины, формамид является весьма сильным денатурирующим агентом. Он полностью разрушает вторичную Структуру полинуклеотидов—как водородные связи, так и стэ- инг-взаимодействие между плоскостями гетероциклических ко-Мп нуклеиновых оснований. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в гелях с формамидом зависит только от молекулярной массы, что открывает возможность ее определения р помощью маркеров и для высокомолекулярной РНК. [c.135]

Направление У — электрофорез в 1%-ном геле агарозы направление 2 — электрофорез в 4%-ном ПААГ, полимеризованном в градиенте концентрации денатурирующих добавок (0—7 М мочевины и О—40% формамида) [c.136]

Успешное прохождение ДНК-полимеразой трудных участков за счет тех или иных описанных выше ухищрений является только половиной дела, поскольку в новосинтезированной комплементарной цепи ДНК также будут присутствовать эти участки с потенциальной вторичной структурой. После денатурации цепей ДНК в этих местах одноцепочечной ДНК образуются шпилечные структуры, заметно меняющие электрофоретическую подвижность такой молекулы ДНК. Результатом будет видимая на конечном радиоавтографе компрессия отдельных полос, не позволяющая их однозначное прочтение . Проведение гель-электрофореза при повышенных температурах или с добавлением в буфер формамида в качестве дополнительного денатурирующего агента, кроме мочевины, в ряде случаев позволяет избежать эффект компрессии. Был также предложен способ ликвидации эффекта компрессии при электрофоретическом разделении продуктов секвенирующих реакций, заключающийся в проведении дополнительного эта- [c.114]

Денатурацию нуклеиновых кислот успешно обеспечивает и более низкая концентрация формамида. Например, показано, что 3%-ный денатурирующий гель (С=11) для электрофореза РНК можно готовить на 65%-ном водном формамиде [Bean et al.. [c.137]

В одной недавней работе [Rave et al., 1979] был описан электрофорез поли (А)-РНК в денатурирующем геле агарозы, содержащем 67о формальдегида в 0,04 М Na-фосфатном буфере. РНК перед нанесением на гель денатурировали в 50%-ном растворе формамида с 6% формальдегида в том же буфере при 60 в течение 5 мин. Затем препарат быстро охлаждали и добавляли в него, как обычно, глицерин и бромфеноловый синий. В электродные резервуары заливали такой же буфер, содержащий 3% формальдегида. После окончания электрофореза гель вымачивали в течение 5 мин в воде при 60 . Этого было достаточно для снятия формальдегида с РНК, которую затем, после частичного щелочного гидролиза, переводили диффузией из геля на диазобумагу по методу Олвина [Alwine et al., 1977]. Несмотря на предшествующую обработку формальдегидом, поли (А)-РНК на диазобумаге успешно гибридизуется с ДНК. [c.139]

Добавьте 4 мкл-формамИда/красителя/ЭДТА в каждую ячейку (разд. 5) и денатурируйте йри 80 °С 10 мин перед нанесением на гель (рис. 2). [c.42]

Два фрагмента ДНК, различающиеся лишь делецией, инсер-щией или заменой одного нуклеотида, или единственным неспаренным нуклеотидом, можно легко разделить при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза, ДГГЭ [15, 17— 20, 27, 28]. Принцип метода заключается в разделении двухце-почечных фрагментов ДНК электрофорезом в стандартном акриламидном геле с линейным градиентом денатурирующих факторов — мочевины, формамида или температуры. Ниже приводятся теоретические основы метода. Здесь отметим только, что разделение очень похожих фрагментов в геле происходит из-за разных температур плавления их ДНК. [c.128]

I. При проведении электрофореза в денатурирующих условиях растворите образец в 90% формамиде, содержащем 0,02% маркерных красок. Прох ейте на кипящей бане I мин, быстро остудите, после чего нанесите на гель. [c.25]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология