Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Элюция из гелей агарозы

    Элюция из гелей агарозы [c.154]

    Для элюции ДНК из гелей агарозы предложен целый ряд методов, использующих особенности структуры этих гелей, а также возможность их растворения и плавления. [c.154]

    В препаративном варианте для электроэлюции однонитевых рестриктов ДНК из геля агарозы его можно расплавлять и повторно заливать в трубку, на конец которой следует затем надеть заполненный буфером диализный мешочек. Элюцию можно вести в обычном приборе для вертикального электрофореза в трубках. Контроль за выходом ДНК из геля в мешочек удобно осуществлять с помощью бромистого этидия, введенного в состав буфера. [c.158]


    Трубка 2— верхнее резиновое кольцо 5 —кусочек геля агарозы 4— пробка 5 — верхний электродный буфер — заливка агарозой 7 — нижнее резиновое кольцо 8 — камера элюции Р —диализная пленка а — внесение кусочка геля на пробке в трубку б — готовая к элюции система [c.159]

    Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) — один из наиболее эффективных и широко распространенных в настоящее время методов фракционирования и очистки белков. Его используют как на завершающих стадиях эксперимента (аналитический вариант), так и при обработке исходного клеточного гомогената (препаративный вариант). Многие методические приемы, например приготовление гелей полиакриламида н агарозы, окраска белковых полос, элюция белков из гелей и др., роднят ИЭФ с электрофорезом белков, подробно рассмотренным в предыдущей книге [Остерман, 1981]. Фракционирование белков при ИЭФ производится в электрическом поле с помощью тех же приборов, которые используются для электрофореза. Ниже при изложении материала предполагается, что читатель уже знаком с этими методами и аппаратурой. [c.3]

    Элюция с использованием детергентов — пожалуй, наиболее распространенный способ хроматографического фракционирования белков на гидрофобно-модифицированных гелях агарозы. В обеспечении высокой избирательности хроматографического процесса, а тем самым — эффективной очистки нужного белка, ваншую роль играет выбор детергента с учетом особенностей его взаимодействия с очищаемым белком. [c.183]

    В горизонтальном приборе для электрофореза можно вести электрофоретическую элюцию одновременно из нескольких полосок, вырезанных из препаративного геля [Wienand et al., 1979]. На рабочий столик прибора устанавливают пластину 10/о-ного геля агарозы, примерно на 2 мм более толстую, чем исходный гель, в котором проводили фракционирование нуклеиновых кислот. В этой пластине параллельно электродным резервуарам вырезают ряд прямоугольных окон. Ширина окон должна быть примерно вдвое больше, чем ширина полосок элюируемого геля. Диализные мешочки завязывают с двух концов и прорезают вдоль. В окна заливают немного рабочего буфера и укладывают диализные мешочки так, что пленка каждого из них выстилает дно и боковые стороны одного из окон, а разрез в пленке раС полагается сверху. Через эти разрезы в мешочки, заполненные тем же буфером, вносят полоски геля и укладывают их на дно [c.159]

    Естественно, что перенос можно ускорить наложением электрического поля в поперечном направлении — от геля к нитроцеллюлозе или ДБМ-бумаге, т. е. заменить вымывание ДНК из геля ее электрофоретической элюцией. Недавно было описано очень простое устройство для этой цели в виде разъемной рамки из плексигласа с диализной пленкой и электродами из платиновой проволоки Bittner et al., 1980]. Гель агарозы кладут на пропитанный буфером нитроцеллюлозный фильтр или ДБМ-бумагу, с обеих сторон к ним прикладывают пропитанные буфером листки фильтровальной бумаги и все это зажимают между двумя половинками рамки. Ее помещают в ванночку с тем же буфером и включают напряжение поперечного электрофореза . Напряженность электрического поля приходится регулировать в зависимости от величины фрагментов ДНК, чтобы мелкие фрагменты не проскакивали через нитроцеллюлозу или ДБМ-бумагу до того, как они успеют закрепиться на них. Очень крупные молекулы ДНК авторы рекомендуют фрагментировать после электрофореза, обрабатывая их малой концентрацией ДНКазы прямо в геле. [c.164]


    В заключение отметим еще один частный случай избирательной сорбции РНК, вымываемой из геля. Речь идет об элюции мРНК после электрофореза в 2%-ном геле агарозы прямо из измельченного геля на микроколонку олиго (дТ)-целлюлозы. Агарозу на колонке обильно (500 мл на 0,2 г геля) промывают [c.165]

    Для препаративного электрофореза ДНК и РНК в гелях агарозы Хаген использовал трубки диаметром 5,9 или 7,7 см, просто обрезав для этой цели мерные цилиндры на 1 или 2 л. Расплавленную в соответствующем буфере агарозу он заливал на высоту 12—15 см. Камера элюции на нижнем конце цилиндра была образована двумя сетками и диализной мембраной. Элюцию вели непрерывно со скоростью 0,8 мл/мин. В качестве элюента использовали нижний электродный буфер, в который для охлаждения цилиндр погружали на всю высоту геля. Буфер поступал в камеру элюции по ее периферии и отсасывался через трубку, выведенную из центра нижней сетки камеры [Hagen, 1979]. Агароза не прилипает к стеклу цилиндра, поэтому во избежание миграции нуклеиновых кислот по зазору вдоль стенок препарат вносили в углубление меньшего диаметра, чем цилиндр, сформированное на верхнем торце геля агарозы при ее застывании. Заметного перетекания буфера по зазору не происходило, так как гель находился под гидростатическим давлением столба жидкости высотой 10 см (верхний электродный буфер). Проблему нагревания геля решали путем снижения плотности тока в 3— [c.166]

    На трех соединенных последовательно колонках того же типа недавно удалось разделить сходные по молекулярной массе и заряду легкие цеии миозина после обработки его 4 М раствором мочевины. Элюцию вели 0,2 М К-фосфатным буфером в присутствии 2 М мочевины со скоростью 67 мл/см -ч разделение занимало 2,5 ч. Для такого же разделенпя гель-фильтрацией на агарозе требуется около 9 сут IWatabe et al., 1983]. [c.156]

    Назначение диализного мешочка или мембраны состоит в том, чтобы помешать вышедшей из геля нуклеиновой кислоте мигрировать дальше к аноду. Этого можно добиться и другим путем поместить на пути миграции сорбент, прочно связываюший нуклеиновую кислоту, причем сделать это так, чтобы по окончании элюции и сорбции нуклеиновой кислоты можно было бы легко извлечь сорбент из геля и уже из него простыми средствами элюировать нужный препарат. Этот вариант имеет еще и то преимущество, что сорбент может избирательно сорбировать только нуклеиновую кислоту и тем самым осуществлять ее очистку от следов агарозы и других примесей, выходящих из геля. [c.160]

    По-видимому, для препаративного электрофореза нуклеиновых кислот следует предпочесть другую систему [Polsky et al., 1978]. В этом случае разделение 35 мг рестриктазных фрагментов ДНК проводили в горизонтальной пластине агарозы сечением 45 см1 Для внесения препарата в гель и его элюции служили прямоугольные камеры, прилегающие к торцам пластины (рис. 43), Камера элюции объемом 12 мл была отделена от сле- [c.166]


Смотреть страницы где упоминается термин Элюция из гелей агарозы: [c.5]    [c.64]    [c.174]    [c.158]    [c.160]    [c.108]    [c.426]    [c.59]    [c.159]    [c.144]   
Смотреть главы в:

Электрофорез и ультрацентрифугирование -> Элюция из гелей агарозы

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот Электрофорез и ультра-центрифугирование -> Элюция из гелей агарозы




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

Гели агарозы



© 2025 chem21.info Реклама на сайте