Сорбция нуклеиновых кислот

СОРБЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ [c.229]

Кизельгур (целит) нашел себе применение главным образом в качестве сорбента, фиксирующего неподвижную жидкую фазу в распределительной хроматографии, например в рассмотренной выше обратнофазовой хроматографии типа ХОФ-5. Кроме того, его использовали для прочной сорбции метилированного по карбоксильным остаткам белка при создании специфического сорбента для нуклеиновых кислот. В конце 60-х годов колонки с сорбентом такого рода (МАК-колонки) были весьма популярны, но сейчас нх вытеснили более совершенные варианты хроматографии НК. [c.224]

Использование высокой сорбционной способности стекла (в виде гранул пористого стекла) для адсорбционной хроматографии белков, нуклеиновых кислот и их компонентов оказалось, вопреки первоначальным ожиданиям, делом малоперспективным из-за тех же трудностей, связанных с плохой воспроизводимостью и необратимостью сорбцией. [c.224]

Разделение различных фракций РНК, ДНК и их гибридов основано на различии в прочности сорбции одно- и двухнитевых молекул нуклеиновых кислот прочность сорбции фрагментов нуклеиновых кислот повышается с увеличением их длины. Десорбция вызывается увеличением концентрации фосфатного буфера. [c.171]

Стремительное развитие биоорганической химии, физической химии полимеров и молекулярной биологии дало хроматографии новый объект исследований — высокомолекулярные соединения. Возникла необходимость в разделении синтетических полимеров и биополимеров, нуклеиновых кислот, белков, а также вирусов, фагов, рибосом и пр. Достигнутый в этом направлении успех позволил одному из крупнейших специалистов в области молекулярной биологии Френсису Крику сказать, что хроматография наряду с рентгеноструктурным анализом, электронной микроскопией и ультрацентрифугированием обеспечила все наиболее крупные успехи молекулярной биологии. Здесь следует особо выделить методы фракционирования биополимеров на ионообменных целлюлозах [2] и основанную на биоспецифической сорбции афинную хроматографию [3]. [c.10]

Изучение структуры и свойств белков и нуклеиновых кислот шагнуло далеко вперед после создания совершенных методов их выделения и очистки. Помимо ранее широко применявшихся методов осаждения, кристаллизации и диализа, для этой цели стали использоваться методы электрофореза, хроматографии, сорбции и противоточной экстракции. Ввиду того что природа биополимеров как полиэлектролитов проявляется во всех физико-химических процессах, возникает необходимость рассматривать электрохимические свойства белков и нуклеиновых кислот, что удобнее всего осуществлять с помощью потенциометрического титрования. [c.5]

Основные успехи разделения биополимеров в гетерогенных системах достигнуты при использовании равновесия между раствором и твердой фазой. Одними из наиболее ранних приемов, сохранивших свое значение и до настоящего времени, являются методы осаждения и кристаллизации. Еще большее значение в настоящее время играют процессы сорбции и их динамическая модификация — процессы хроматографии. Одноактная сорбция белков на окислах металлов и других минеральных сорбентах служит для очистки белков и ферментов уже несколько десятилетий. К этим процессам присоединилась избирательная сорбция белков ионообменными смолами. Одним из наиболее значительных достижений современной физической химии в области фракционирования сложных смесей веществ, в частности белков, нуклеиновых кислот, полипептидов, аминокислот и нуклеотидов, явилась хроматография, особенно в виде ее ионообменной модификации и гельфильтрации на сефадексах. [c.7]

Методы разделения смесей веществ представляют ценность не только как начальная ступень практически любого эксперимента в области исследования биополимеров, так как выделенный и очищенный белок или нуклеиновая кислота претерпевают с течением времени изменения как в растворе, так и в кристаллическом виде или в виде осадка, но и как методы непосредственного изучения свойств биополимеров. Изучение электрохимических свойств белков, нуклеиновых кислот, нуклеотидов, полипептидов методами электрофореза и сорбции, изучение их морфологии методами сорбции и хроматографии представляет собой столь же важную область применения этих методов, как и наиболее до настоящего времени распространенное их приложение для фракционирования и анализа смеси веществ. [c.9]

Несмотря на тщательную промывку, нередко можно обнаружить значительный фон радиоактивности за счет неспецифической сорбции молекул предшественника на материале фильтра или на самом осадке биополимера. Для его уменьшения имеет смысл добавить в ТХУ холодный предшественник в 100-кратном избытке по отношению к радиоактивному. При исследовании белкового синтеза им может служить идентичная радиоактивной аминокислота, при изучении синтеза нуклеиновой кислоты — соответствующий нерадиоактивный нуклеозидтрифосфат или, что дешевле, просто пирофосфат, поскольку сорбция трифосфатов идет, как правило, по остаткам фосфорной кислоты. Кстати, пирофосфат — мощный ингибитор синтеза нук- [c.214]

Описанный прием идентификации можно использовать во всех случаях, когда белок способен образовывать специфические комплексы (гормон—рецептор, рецептор—цАМФ, белок—нуклеиновая кислота и др.), — конечно, при условии, что его активные группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу. Впрочем, последнее требование может относиться лишь к небольшой доле молекул белка данного типа, достаточной для идентификации всей полосы. [c.108]

Оксиапатпт сорбирует довольно широкий спектр биополимеров, куда входят кислые и щелочные бедки, нативные двунитевые ДНК, денатурированные однонитевые ДНК и РНК. Незаряженные макромолекулы, например полисахариды, не сорбируются, так же как аминокислоты, короткие пептиды и нуклеотиды. Нуклеиновые кислоты сорбируются прочнее, чем белки, двунитевые ДНК — прочнее, чем однонитевые. Сорбции нуклеиновых кислот и кислых белков [c.225]

I Механизм сорбции нуклеиновых кислот и их производных на оксиапатите, ио-видимому, во многом аналогичен механизму сорбции кислых белков. Вместо карбоксилов во взаимодействии с ионами кальция на поверхности сорбента участвуют остатки фосфатов полинуклеотидной цепи. Для моно- и олигонуклеотидов наблюдается явная зависимость силы сорбции от длины цеии (из-за многоточечной сорбции Мононуклеотиды в присутствии 1 мМ фосфатного буфера задерживаются на сорбенте слабо, а основания и нуклеозиды не задерживаются вовсе. Ди- и тринуклеотиды сорбируются гораздо прочнее решающую роль играют здесь фосфаты. Любопытно, что сказывается не только их число, но и расположение) Наиример, нуклеозидтрифосфаты сорбируются заметно прочне ё чем тринуклеотиды. Небольшие олигонуклеотиды хорошо сорбируются в 1 мМ фосфатном буфере, но относительно легко элюируются (0,02—0,0.3 М фосфатным буфером). орбция самих нуклеиновых кислот гораздо более прочна ]Я1 Элюцию осуществляет фосфатны буфер с концентрацией 0,12—0,25 М Размер высокомолекулярной нуклеиновой кислоты сказывается мало. По-видимому, достаточно отдаленные участки длинной цепи полинуклеотида благодаря их гибкости элюируются одновременно и независимо друг от друга. [c.229]

Назначение диализного мешочка или мембраны состоит в том, чтобы помешать вышедшей из геля нуклеиновой кислоте мигрировать дальше к аноду. Этого можно добиться и другим путем поместить на пути миграции сорбент, прочно связываюший нуклеиновую кислоту, причем сделать это так, чтобы по окончании элюции и сорбции нуклеиновой кислоты можно было бы легко извлечь сорбент из геля и уже из него простыми средствами элюировать нужный препарат. Этот вариант имеет еще и то преимущество, что сорбент может избирательно сорбировать только нуклеиновую кислоту и тем самым осуществлять ее очистку от следов агарозы и других примесей, выходящих из геля. [c.160]

Примеры использования оксиапатита для разделения одно- и двунитевых молекул нуклеиновых кислот и соответствующие практические рекомендации будут приведены в следующих разделах. Общее рассмотрение сорбции НК на оксиапатите закончим указанием на то, что на 1 мл уиакованного оксиапатита можно сорбировать 0,2—0,5 мг ДНК, однако для целей фракционирования ие следует превышать первой из этих цифр. Присутствие ЭДТА и цитрата препятствует сорбции, по-видимому, за счет блокирования кальция на поверхности сорбента. Следует упомянуть о том, что в аналитических опытах при избытке сорбента не только элюцию, но и исходную сорбцию НК на оксиапатите следует производить достаточно медленно, например в течение 30 мин, с тем чтобы дать возможность молекулам ДНК или РНК отыскать наиболее благоприятное для сорбции расположение на поверхности сорбента. [c.230]

Для зонного электрофореза ацетатцеллюлозную мембрану (САМ) первым использовал Кон [51]. По мнению Кона, преимущества этого носителя — его однородность и строго определенная пористость. САМ содержит пренебрежимо малое число ОН-групп, загрязненность органическими и неорганическими примесями также весьма мала. В тех случаях, когда сильная сорбция может приводить к образованию на бумаге полосок сзади зон (как, например, при электрофорезе биополимеров) важным преимуществом становится пониженная сорбционная активность САМ. В отличие от бумаги САМ позволяет получить хорошее разделение агфракции сывороточного альбумина, а также инсулина, фибриногена, гистонов, лизоцимов, глико- и липопротеинов и нуклеиновых кислот. После электрофореза меченых соединений остаточная радиоактивность между зонами и стартом исключительно мала. Обесцвечивание фона, если обнаружение проводится путем окрашивания и последующего обесцвечивания, происходит достаточно быстро. [c.293]

Аминокислоты, пептиды и другие амфотерные соединения диссоциированной форме в водных растворах находятся исключительно в виде амфотерных ионов. Заряд этих ионов может меняться в зависимости от pH среды. Соответствующие соотнощения приведены в табл. 5.2. В виде цвиттер-ионов, т. е. ионов с зарядами обоих знаков, аминокислоты существуют только в нейтральной среде. В кислой среде подавляется диссоциация карбоксильной группы и аминокислота ведет себя как катион, а в щелочной среде исключается протонированне с образованием аммониевой группы и цвиттер-ион превращается в анион. Степень диссоциации определяется константами диссоциации р/С] и зависимость этих величин от pH выражается уравнениями Хендерсона-Хассельбальха. Величина р/С — эта pH, при котором соответствующая группа диссоциирована на 50%. Изоэлектрическая точка р/ представляет собой среднее арифметическое констант диссоциации. Если рассматривать процесс как чисто ионный обмен, то степень связывания аминокислоты с катионитом в кислой среде определяется величиной р/Сь степень связывания аминокислот на анионитах в щелочной среде определяется соответствующими величинами р/Сг-Эта теоретическая зависимость нарушается другими сорбционными процессами, обусловленными взаимодействием боковых цепей аминокислот или пептидов с матрицей ионита. Аналогичная зависимость наблюдается при диссоциации и сорбции компонентов нуклеиновых кислот. Более подробно диссоциация сорбция амфотерных ионов на ионитах обсуждаются в работе [122]. [c.241]

Адсорбция — это процесс, обусловленный вандерва-альсовыми силами, электростатическим и гидрофобным взаимодействиями, а также стерическими факторами. Адсорбция индивидуального вещества описывается типичной изотермой адсорбции Ленгмюра, которая представляет собой гиперболу на графике зависимости концентрации растворенного вещества от количества адсорбированного вещества. Такой же кривой описывается и насыщение фермента субстратом, а также закон убывающего плодородия . Поверхностную сорбцию и элюцию неполярных веществ успешно осуществляют с помощью силикагеля, кизельгура, окиси алюминия, фло-рисила и активированного угля. Полярные макромолекулы, такие, как белки и нуклеиновые кислоты, очищают либо методом статической сорбции, либо в условиях колоночной хроматографии с использованием гидрокси-апатита, кальций-фосфатного геля или Су -модификации окиси алюминия. [c.202]

Почвенное органическое вещество вследствие высокой удельной по-верхности (до 800 м /г) и катионообменной емкости обеспечивает буферные свойства почвенной среды, сорбцию, связывание, удерживание воды и разнообразных химических веществ, включая макро- и микроэлементы, ферменты, белки, нуклеиновые кислоты, витамины и другие физиологически активные соединения. [c.137]

Первичным актом эндоцитоза является сорбция молекул внешней поверхностью плазмалеммы. На примере изучения пиноцитоза у амеб было замечено, что внесение в среду инкубации белков индуцирует эндоцитоз. Эти исследования показали, что индукторами эндоцитоза являются растворимые (главным образом основные) белки. Эти белки содержат положительно заряженные группы, связывающиеся с отрицательно заряженными груп-лами гликокаликса или самой поверхностью мембраны (электрически нейтральные вещества — углеводы, нуклеиновые кислоты не стимулируют пиноцитоз). Эндоцитозу способствуют не только электростатическое, но также и гидрофобные взаимодействия, возникающие между неполярными участками мукополисахаридного слоя гликокаликса и захватываемого материала. [c.13]

Слабополярные или неполярные гидрофобные вещества в тканевых клетках являются малоэффективнымп индукторами. Сорбция такого рода веществ гликокаликсом и (или) плазмалеммой будет определяться наличием в них положительно заряженных гидрофильных групп (например, кислые фосфолипиды). Нейтральные (сахара) или кислые (нуклеиновые кислоты, красители) соединения на тканевых клетках, как правило, не индуцируют эндоцитоз, однако эти вещества могут пассивно захватываться клетками в присутствии различных кофакторов. [c.14]

Не вызывает сомнений высокая эффективность полиэтилен-иминового метода в отношении высаждения нуклеиновых кислот. Однако, отмечены случаи, когда проведение такой процедуры не гарантирует последующей сорбции бесклеточног экстракта на ионитах из-за присутствия в них каких-то не-идентифицированных интерферирующих этому процессу клеточных растворимых компонентов [43]. Выходом из создавшейся ситуации оказалось использование вместо ПЭИ стрептомицин-сульфата или хроматографическое фракционирование грубых экстрактов на ДЭАЭц [43]. [c.147]

Процедура разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз с использованием ДЭАЭц проводится в двух вариантах 1) при значениях ионной силы, исключающих задерживание на сорбенте целевого фермента и не препятствующих сорбции на нем нуклеиновых кислот — в условиях, обеспечивающих разделение целевых ферментов и нуклеиновых кислот уже во время контакта грубых экстрактов с анионитом 2) в условиях, когда оба компонента связываются анионитом и их разделение осуществляется при последующей элюции с колонки. [c.150]

ДЭАЭц связывает нуклеиновые кислоты за счет своих анионообменных групп. Как уже отмечалось, это приводит в некоторых вариантах выполнения опытов к одновременной сорбции на ионите как нуклеиновых кислот, так и целевых ферментов, что в принципе не исключает их взаимного загрязнения в ходе хроматографического фракционирования. Этим недостатком не обладают катиониты, в принципе неспособные связывать нуклеиновые кислоты за счет электростатических взаимодействий. [c.151]

Описанный прием идентификации можно использовать во всех случаях, когда белок способен образовьшать специфические комплексы (гормон—рецептор, рецептор—цАМФ, белок—нуклеиновая кислота и др.), — конечно, при условии, что его активные группы остаются открытыми при сорбции на нитроцеллюлозу. [c.108]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология