Белки гибридные, конструирование

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

Конструирование и клонирование гибридных белков, содержащих -галактозидазу [c.141]

Целью конструирования гибридных белков является улучшение свойств, имеющихся у исходных макромолекул, для более производительного их использования в биотехнологии, а также создание белков и ферментов с новыми свойствами. Работы в области гибридных белков, с одной стороны, направлены на изменение кинетических параметров ферментов, их субстратной специфичности, оптимума pH, термостабильности и других биотехнологических параметров. При другом подходе усилия исследователей сосредоточены на создании бифункциональных и многофункциональных белковых молекул, объединяющих в одной полипептидной цепи несколько функционирующих доменов. [c.375]

Приведенные примеры иллюстрируют первые шаги, сделанные на пути конструирования ферментов с аллостерическими свойствами. Полученные результаты показывают потенциальную плодотворность данного направления исследований. Однако для наиболее полного воплощения этих идей в жизнь при конструировании таких полипептидов необходимо учитывать пространственные особенности взаимодействия объединяемых каталитических доменов в гибридных белках, а это невозможно без понимания связей между первичной и пространственной структурами изучаемых полипептидов, что, впрочем, относится и ко всей области рационального дизайна белковых молекул. Интенсивные структурные исследования белков с высоким разрешением и молекулярное моделирование в конце концов позволят решать такого рода проблемы. [c.382]

Конструирование гибридных белков. Получение гибридных (слитых) белков — стандартная задача генетической инженерии, ставящая целью экспрессию, секрецию, детекцию или очистку целевого белка (см. гл. 10). В контексте белковой инженерии [c.443]

При конструировании гибридных генов кодирующую последовательность можно помещать под контроль тандемно повторенных промоторов. Это, как правило, приводит к увеличению эффективности транскрипции изучаемого гена. Собирая блоки из двух-трех различных промоторов с разной системой репрессии-индукции, можно гибко регулировать экспрессию целевого гена и обеспечивать сверхсинтез кодируемого им белка. [c.267]

В задачу авторов не входит описание методов конструирования рекомбинантов Xgtll, кодирующих гибридные белки, поскольку в одной из книг данной серии уже имеется соответствующая глава [12]. Мы рассмотрим лишь методы скрининга и очистки детерминируемых вектором гибридных белков igtll, которые можно использовать как для выявления нужных клонов, так и для получения антисыворотки к гибридным белкам. [c.140]

На сегодня существуют три способа конструирования, обеспечивающие трансляцию чужеродной генетической информации в клегках бактерий. Первый способ — внедрение чужеродного структурного гена, лишенного собственных регуляторных областей, внутрь хорошо экспрессируемого бактериального гена. Точка внедрения должна быть достаточно удалена от места инициации трансляции, чтобы новая нуклеотидная последовательность не мешала эффективной инициации транскрипции и трансляции бактериального гена. При такой конструкции можно ожидать, что уровень экспрессии гибридного белка будет близок уровню экспрессии исходного гена. Недостаток метода — трудность последующего расщепления гибридного белка и выделения конечного продукта (рис. 28, а). [c.157]

Тот же принцип подавления инфекции, вызванной вирусами ВИЧ, растворимыми рецепторами D4 был использован при конструировании гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей D4 с константными частями тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов человека. При этом в процессе объединения генов были удалены последовательности нуклеотидов, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены D4, а также вариабельную часть полипептидных цепей иммуноглобулинов. Образующиеся гибридные молекулы, названные иммуноадгезинами, за счет константной части молекулы иммуноглобулина приобретали повышенную стабильность в организме и, кроме того, сохраняли специфические свойства, опосредуемые константными частями иммуноглобулинов связывание F -рецептора и белка А, способность к фиксации комплемента и [c.395]

Рис. 13-5- Строение вспомогательной плазмиды BlueBa His2, используемом конструирования рекомбинантных бакуловирусов Знак с> в дуплексе — инициирующий кодон для синтеза гибридного белка, M S — полилинкер для встраивания целевого гена

Несмотря на то, что механизмы регуляции трансляции изучены пока недостаточно полно, при конструировании гибридных генов, предназначенных для автономной трансляции целевого белка в Е. соН, активно используют природные или синтетические последовательности ДНК, кодирующие SD-участки и прилегающие к ним области. Это позволяет создавать эффективно функционирующие районы связывания рибосом на гибридных мРНК. Чаще всего используют SD-участки генов белка оболочки фага MS2, la Z Е. oli и сП фага А. [c.152]

Новые типы лечебных препаратов можно получить, если создать белок, обладающий биологическими активностями, свойственными двум или более неродственным белкам. На принципиальную возможность конструирования таких молекул указывает наличие мультифункциональных природных белков, которые могут различаться по своей организации у прокариот и эукариот. Первую успешную работу в данном направлении выполнили М. Сено с соавторами (1986 г.). Они создали гибридный ген, который кодировал химерный белок, состоящий на N-конце из 135 АК HuIFN-y (делеция 11 АК с С-конца) и из 134 АК интерлейкина 2 человека (IL-2) на С-конце (полная последовательность). Иммунный интерферон соединили с ин- [c.193]

Помимо суперпродукции, повышенной гидро-фобности и неправильного образования дисульфидных связей формированию водонерастворимых конгломератов чужеродных белков в Е. со// способствуют и другие факторы, которые пока точно не известны. Однако совершенно ясно, что в нерастворимых включениях белок, по крайней мере частично, денатурирован, а для его перевода в растворимую форму требуется полная денатурация с разрушением дисульфидных связей. Для растворения белковых телец включения их обрабатывают в жестких денатурирующих условиях додецилсульфатом натрия, гуа-нидингидрохлоридом, мочевиной и т. п. с добавлением 2-меркаптоэтанола, дитиотреитола и др. Заключительным этапом очистки таких белков является их ренатурация, необходимая для получения функционально активного продукта. Удельная активность ре-натурированного генно-инженерного белка при этом часто не достигает уровня, свойственного природной форме. Получаемый таким образом препарат содержит балласт в виде измененных форм целевого белка, который может вызывать негативные эффекты при попадании в организм человека или животных. Поэтому при конструировании бактериальных штаммов — продуцентов эукариотических белков медицинского назначения необходимо стремиться к получению целевого белка в растворимом виде и не допускать его преципитации. Наиболее просто добиться высокого уровня продукции эукариотического белка без формирования телец включения можно, создавая штаммы, секретирующие этот белок в окружающую среду. Продуктивен также подход с использованием экспрессирующих векторов широкого круга хозяев и последовательным введением полученных на их основе гибридных плазмид в разные бактерии для поиска оптимальной пары. [c.284]