Введение молекул ДНК в клетки млекопитающих

ВВЕДЕНИЕ МОЛЕКУЛ ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ [c.332]

Рис. 13.2. Введение молекул ДНК в клетки млекопитающих с использованием катионного липидного реагента (КЛР)

Вследствие крайней сложности белкового набора, синтезируемого клетками млекопитающих, изучение всей проблемы на молекулярном уровне требует много времени и часто приводит к неоднозначным результатам. Практически очень интересной кажется область иммунологических исследований изучается реакция многоклеточных систем на введение чужеродных тел-антигенов. Антигены — это, как правило, макромолекулы-белки или полисахариды попадая в организм, они вызывают образование особых плазматических клеток, синтезирующих антитела. Антитела, покинув клетку, вступают в контакт с антигеном. Антитела имеют в молекуле две точки одна специфична и в отношении химической природы, и в отношении пространственной конфигурации, а другая сходна у различных антител. Антитела соединяются с антигеном, и продукт реакции выводится из организма особыми клетками, поглощающими весь возникший комплекс антиген — антитело. Вероятно, появление антигена стимулирует образование плазматических клеток из каких-то предшественников и затем вызывает синтез специфической м-РНК, на которой и получается белок, рассчитанный на захват данного антигена. [c.214]

Микроинъекция вирусных молекул ДНК. А. Грессман (1970 г) для введения молекул ДНК в культивируемые клетки млекопитающих предложил использовать метод микроинъекции. Процедура заключается во введении в клетку (цитоплазму или ядро) малых объемов жидкости (около 10 мкл) с помощью стеклянного микрокапилляра (рис. 13.1). Эксперимент проводится на предметном столике микроскопа с применением микроманипуляторов и микрошприцев. Используя эту методику, удалось изучить биологическую активность молекул ДНК разных вирусов. К достоинствам метода относится то, что определенное количество препарата ДНК можно ввести в выбранную область клетки, в частности в ядро. Недостатком метода является его сложность и невысокая производительность. Кроме того, по-видимому, он применим лишь к небольшим молекулам ДНК, так как при продавливании через микрокапилляр целостность больших молекул ДНК будет нарушаться вследствие гидродинамического сдвига. В силу отмеченных недостатков метод микроинъекции при анализе инфекционности вирусных ДНК используется крайне редко. [c.334]

Щелочные фосфатазы бактерий (ВАР) и кишечника теленка ( IAP) катализируют удаление 5 -фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дез-оксирибонуклеозидтрифосфатов. Их используют при подготовке фрагментов нуклеиновых кислот к введению З -концевой радиоактивной метки З2р а также для предотвращения лигирования векторных молекул ДНК самих на себя. Как уже упоминалось выше, ДНК-лигаза способна образовывать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах лишь при наличии в них 5 -концевого фосфата. Удаление 5 -концевых фосфатных групп молекул вектора, линеаризованных с помощью одной рестриктазы во время подготовки его для клонирования соответствующего фрагмента ДНК, предотвращает образование кольцевых молекул вектора (без вставки), а также его олигомеров во время лигирования с клонируемой последовательностью. Необходимые для лигирования со вставкой фосфатные группы содержатся в самих клонируемых фрагментах ДНК, а остающиеся в результате неполного лигирования два одноцепочечных разрыва репарируются in vivo после введения вектора со вставкой в бактериальные клетки. Гены секретируемых щелочных фосфатаз находят применение и в качестве высокочувствительных генов-репортеров при исследовании функционирования регуляторных элементов различных генов в прокариотических и дрожжевых системах экспрессии, а также в клетках млекопитающих [91]. [c.65]

Как видим, в настоящее время имеется широкий спектр методов введения молекул ДНК в культивируемые клетки млекопитающих. Это обеспечивает возможность проведения разнообразных генно-инженерных экспериментов в данной эукариотической системе. [c.338]

С появлением генетической инженерии методология введения молекул ДНК в клетки млекопитающих привлекла внимание многих исследователей. К этому времени уже бьш разработан ряд методов трансфекции культивируемых клеток животных нуклеиновыми кислотами различных вирусов. [c.332]

Изучение экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих представляет большой интерес. Однако первоначальное клонирование фрагментов ДНК и отбор гибридных молекул наиболее просто осуществлять в бактериальных клетках. Поэтому необходимо было исследовать возможность введения бактериальных плазмид и клонированных фрагментов ДНК в культивируемые клетки животных и изучить их поддержание в таком гетерологичном окружении. [c.335]

Использование катионных липидных реагентов. В последние годы разработаны катионные липидные реагенты (липофектин, ли-пофектамин, селфектин и др.), которые обеспечивают простое, быстрое и воспроизводимое введение молекул нуклеиновых кислот в культивируемые клетки млекопитающих и насекомых. Раствор ДНК просто смешивают с фирменным катионным липидным реагентом и наносят на монослой культуры клеток (рис. 13.2). При этом эффективность введения ДНК в эукариотические клетки обычно превышает таковую при использовании ДЭЛЭ-декстранового или кальций-фосфатного методов. [c.335]

До недавнего времени при введении молекул ДНК в клетки млекопитающих наиболее часто использовали кальций-фосфатный и ДЭАЭ-декстрановый методы, так как они достаточно просты и обеспечивают высоковоспроизводимые результаты. Однако активно ведутся поиски других, более простых и эффективных методов трансфекции вирусными ДНК. [c.334]

Для введения таких молекул ДНК в клетки млекопитающих прежде всего были опробованы методы, ранее разработанные для трансфекции клеток вирусными нуклеиновыми кислотами. Как и ожидалось, они оказались пригодными и в этих случаях. До недавнего времени кольцевые плазмиды и линейные фрагменты ДНК в клетки животных в основном вводили кальций-фосфатным и ДЭЛЭ-декстрановым методами. Когда необходимо осуществить генетическую трансформацию, т. е. интегрировать фрагмент ДНК в геном клетки, предпочтительнее использовать кальций-фосфатный метод, так как он в этом случае обеспечивает ббльшую эффективность. Если требуется сохранить целостность вводимой кольцевой молекулы ДНК, то обычно преимущество имеет ДЭАЭ-декстрановый метод. [c.335]

Иначе обстоит дело с клетками млекопитающих. Здесь мы пока не в состоянии установить, как и куда включилась в хромосому введенная в клетку ДНК. В среднем лишь один акт интефации на тысячу приводит к замене одного гена другим. Вместо этого клеточные ферменты быстро сшивают линейные фрагменты ДНК конец-в-конец и такой длинный тандем обычно включается в хромосому в каких-то, по-видимому, случайных, участках. Оплодотворенные яйца млекопитающих ведут себя в этом отношении так же, как и прочие клетки млекопитающих. Если ввести в яйцо мыши 200 копий линейной молекулы ДНК, то часто из него развивается мышь, у которой в одну из ее хромосом в случайном участке интефированы эти тандемно повторяющиеся копии введенного гена (рис. 5-88). В том случае, когда модифицированная хромосома присутствует и в половых клетках (яйцеклетках или спфматозоидах), мышь пфедаст эти новые полученные ею гены своему потомству животные с таким устойчивым изменением называются трансгенными. Поскольку нормальный ген у них, как правило, сохраняется, трансгенные животные по большей части непригодны для столь убедительной, как у дрожжей, демонстрации эффектов, связанных с изменением гена однако с их помощью были уже получены важные сведения о том, как осуществляется регуляция генов млекопитающих (см. стр. 10.3.11) и каким образом некоторые гены (их называют онкогенами) обусловливают возникновение рака (см. разд. 21.2.5). [c.339]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология