Трансфекция

Процесс инфицирования клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, назван трансфекцией. [c.121]

При трансфекции Е8-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых [c.422]

Если в вектор встроить рестрикционный фрагмент, содержащий некий экзон А и фланкирующие его интроны, то после трансфекции процессированный транскрипт будет содержать три экзона экзон 1-экзон А-экзон 2. Длина ПЦР-продукта будет больше, чем в тех случаях, когда в векторе нет вставки, когда вставка содержит экзон без функциональных сайтов сплайсинга (донорного и акцепторного) или когда вставка вообще не содержит экзона. Если во вставке присутствует более одного экзона, каждый из которых имеет функциональные сайты сплайсинга, то процессированный транскрипт будет содержать все эти экзоны. [c.476]

Манн и др. сконструировали первую клеточную линию для упаковки ретровирусов. Для этого они встроили вирусный геном с предварительно удаленной нуклеотидной последовательностью, ответственной за упаковку, в хромосому клеточной линии, которая в этих условиях производит неинфекционные вирусные частицы. После трансфекции этих клеток ДНК-конструкцией, которая содержала последовательность, необходимую для упаковки, и терапевтический ген, но не содержала ретровирусные гены. [c.492]

Для доставки в клетки крупных генетических конструкций (>10 т. п. н.) с помощью эндосом-ного клеточного транспорта, позволяющего избежать лизосомного разрущения ДНК, образуют конъюгат ДНК с другими молекулами. Для этого поли-Ь-лизин ковалентно сшивают с молекулой, связывающейся со специфическим клеточным рецептором, а затем добавляют ДНК. В результате получается компактная, плотно скрученная структура (тор), на внешней поверхности которой располагаются сайты связывания с клеточным рецептором (рис. 21.11). К сожалению, подобный конъюгат, несмотря на свою специфичность, обладает низкой эффективностью трансфекции. Все созданные к на- [c.501]

Трансформация, трансфекция, клонирование и селекция [c.433]

В пашей лаборатории осуществлен синтез новых димерных катионных амфифилов на основе 1.-1 лутаминовой и Ь-аспара1 иновой кислот. Исследованы мембранообраз тощие свойства димеров, показана их низкая токсичность, способность образовывать устойчивые агрегаты с ДНК и участвовать в процессе трансфекции. [c.159]

Влияние соседних оснований яа частоту возникновения мутаций отмечалось и ранее для прокариотических ДНК-полю-юраз. Авторы [17] предполагают, что соседние основания слева и справа могут иметь большое значение для стабилизации неканонической пары, возникающей в ходе репликации. Похожие закономерности выявлены при анализе спонтанных мутаций, возникающих при трансфекции вектора pZI89 в клетки обезьяны. Для всех мутантных позиций оказалось характерным наличие слева вполне определенных нуклеотидов. Консенсус имеет вид ТС, где нуклеотид С - позиция мутирования. Предполагается, что эти мутации возникли в ходе репарации трансфецированной ДНК, поврежденной клеточными нуклеазами [171. [c.103]

С помощью плазмид можно также осуществить Т. протопластов (клетки с удаленной клеточной стенкой), к-рые затем регенерируют в полноценные клетки. ДНК, проникая в них, почти не повреждается и остается двунитевой. Плаз-мидная Т. во многом близка к т.наз. трансфекции, когда бактерии поглощают ДНК фага (вирус бактерий), предварительно выделенную из фаговых частиц. Эта ДНК в бак-терщ1 кодирует образование новых частиц фага, к-рые разрушают затем бактериальную клетку и выходят наружу. [c.626]

Практически общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий a l2 их мембрана становится проницаемой для ДНК. Однако эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку довольно низка. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается трансформированной. Отделение ее от общей массы осуществляется в процессе клонирования. Для клонирования бактериальную суспензию определенной концентрации выливают на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри из расчета 5—10 бактерий на 1 см поверхности. Бактериальная клетка на поверхности агара начинает делиться с образованием в итоге маленькой колонии, похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном, причем из каждой клетки образуется свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника. [c.121]

Для трансформации дрожжей обычно используют три способа. В первом случае экзогенную ДНК добавляют к клеткам дрожжей, клеточные стенки которых удалены химически или энзиматически (протопласты) (1). В других случаях клетки перед добавлением чужеродной ДНК обрабатывают ацетатом лития (2) или подвергают электропорации (3). Трансфекцию культур животных клеток осуществляют инкубацией клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕАЕ-декстраном (1), либо электропорацией в присутствии очищенной трансфицирующей ДНК (2). Как уже упоминалось в гл. [c.136]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Трансгенньгх мышей получали микроинъекцией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток с помощью YA , несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных генов Р-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т. п. н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время - точно так же, как это происходит у человека. Такое соответст- [c.428]

Рис. 19.14. Получение трансгенных цыплят трансфекцией изолированных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям.

Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с использованием рекомбинантных эмбриональных клеток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародыше-вую область свежеотложенных яиц (рис. 19.14). Часть потомков будет нести в каком-то небольшом количестве клетки донора таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных животных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках зародышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрионов реципиента перед введением в них трансфицированных клеток (540-660 рад в течение 1 ч). Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клетками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффективностью. [c.438]

Рис. 20.29. Продолжение) Б. В полилипкер вектора для улавливания экзонов встроен фрагмент ДНК человека, и эта конструкция введена в эукариотическую клетку (трансфекция). В данном случае экзон содержит функциональные акцепторный и донорный сайты сплайсинга. При процессинге первичного транскрипта удаляются интроны, фланкирующие экзон А, и он оказывается между экзонами 1 и 2. Длина ПЦР-продукта обратного транскрипта показывает, пойман ли искомый экзон между экзонами 1 и 2 и, следовательно, содержит ли его данная вставка.

Рис. 21.1. Схематическое представление генной терапии ех vivo. Процедура включает 1) получение от пациента клеток с генным дефектом 2) культивирование изолированных клеток 3) трансфекцию терапевтической генной конструкции в изолированные клетки 4) отбор, выращивание и тестирование трансфицированных клеток 5) трансплантацию или трансфузию трансфицированных клеток пациенту.

Большинство систем доставки генов на основе HSV предполагает использование вируса-по-мощника, который поставляет белки, необходимые для репликации и сборки вируса, но не образует инфекционные вирусные частицы, поскольку его геном модифицирован и не способен упаковываться. Для получения рекомбинантного HSV осуществляют трансфекцию ампликон-плазмиды в инфицированную вирусом-помощником клетку-хозяина. ДНК ампли- [c.498]

Рис. 21.9. Вектор на основе HSV-ампликон-плазмиды. Точка инициации репликации HSV (ori HSV), сигнал упаковки HSV и терапевтический ) ген (ТГ) встраивают в плазмиду Е. соН (HSV-ампликон-плазмида). Проводят трансфекцию клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помощником HSV, полученной плазмидой. ДНК ампли-кон-плазмиды реплицируется по типу катящегося кольца . 10 амп-ликонов, соответствующих полноразмерному геному HSV, упаковываются в HSV-капсид, который поставляет вирус-помощник HSV. Геном этого вируса не упаковывается. HSV-частицы, несущие множество копий терапевтического гена, высвобождаются при лизисе клетки и используются для трансдукции нейронов.

Баллистическая трансфекция (Biolisti s, Mi roproje tile bombardment) Введение ДНК в растительные и животные клетки или органеллы с помощью вольфрамовых или золотых шариков. ДНК осаждают, покрывают ею щарики и обстреливают ими клетки. [c.544]

Трансфекция (Transfe tion) Искусственное введение в эукариотические клетки изолированных молекул ДНК. [c.562]

Молекулярная биотехнология принципы и применение (2002) -- [ c.136 , c.150 ]

Биоорганическая химия (1987) -- [ c.433 , c.434 ]

Молекулярная биология клетки Том5 (1987) -- [ c.153 ]

Общая микробиология (1987) -- [ c.147 ]

Гены (1987) -- [ c.23 , c.25 , c.497 , c.500 , c.501 ]

Методы общей бактериологии Т.3 (1984) -- [ c.66 ]

Анализ генома (2001) -- [ c.16 , c.27 ]

Анализ генома Методы (1990) -- [ c.16 , c.27 ]

Искусственные генетические системы Т.1 (2004) -- [ c.0 ]

Основы генетической инженерии (2002) -- [ c.110 , c.189 , c.203 , c.212 , c.214 , c.259 ]

Гены и геномы Т 2 (1998) -- [ c.228 , c.232 , c.241 , c.245 , c.258 , c.290 , c.291 ]

Генетическая инженерия (2004) -- [ c.32 , c.239 , c.332 , c.333 , c.334 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология