Микроинъекции

Рис. 19.2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций. Яйцеклетки выделяют из са-мок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в суррогатную мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей трансгенных линий.

Метод микроинъекций ДНК В настоягцее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем (рис. 19.2). [c.420]

Трансформацию животных клеток можно проводить не только за счет введения в них векторов, несущих чужеродный генетический материал, но и в результате микроинъекций целевых генов непосредственно в ядро животной клетки. Этот метод получил широкое распространение в последние годы. При помощи микрокапиллярной пипетки под микроскопом в ядро клетки вводится 10 —10 л раствора трансформирующей ДНК (несколько тысяч копий генов). [c.506]

Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных кле- [c.148]

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных [c.439]

Вышесказанное можно проиллюстрировать следующими примерами. В США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отвечающий за экспрессию 3-лактоглобулина, который способен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбурге в 1992 г. были вьшедены трансгенные овцы с геном а-1-антитрипсина человека и 3-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомбинантных белков в системах с использованием культуры клеток составляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может повышаться до 1 л. Следует заметить, что создание клеточных культур и их выращивание в промышленных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их обслуживание — дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные легко размножа- [c.131]

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвалифицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в лучшем случае лишь из 5% инокулированных яйцеклеток (рис. 19.3). Ни один из этапов эксперимента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать боль- [c.421]

Генетическая трансформация эмбрионов мыши микроинъекцией очищенной ДНК [c.428]

Открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольтных электрических импульсов). [c.518]

Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК (рис. 19.13). Процедура включала следующие основные этапы. [c.433]

Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов приготовление раствора ДНК для микроинъекции извлечение эмбрионов из донорных организмов микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов. У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем использования традиционных методов разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекхщонного раствора ДНК [c.127]

Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус. [c.433]

Изолированные оперативным вмешательством яйцеклетки из яйцеводов выдерживают в атмосфере 5% СО2 при 37°С до микроинъекции в них клонированных ДНК любого размера в количестве 1—2 нл 0,0001—0,0005% раствора ДНК с помощью микроманипулятора. [c.583]

С конца XIX века и до середины текущего столетия были разработаны методы пересадки эмбрионов от различных животных с последующим рождением полноценного потомства (клеточная инженерия). Следовательно, получение популяции, состоящей из генетически идентичных особей (клонирование), возможно не только с помощью рассмотренных выше трех способов (микроинъекций ДНК, вирусная инфекция и пересадка ES- и ЕК-клеток), но и с помощью пересадки эмбрионов, которая может быть [c.585]

Т. клеток млекопитающих осуществима только искусственно в резуш>тате микроинъекций чужеродной ДНК в ядра эмбрионов, соматич. клеток или путем поглощения ДНК клетками в культуре тканей. Чаще всего ДНК добавляют к смеси р-ра a lj и фосфатного буфера образуется мелкодисперсный осадок, к-рый адсорбируется и поглощается клетками. Возможно также введение ДНК в липосоме или путем использования в качестве переносчика ДНК-содержа-щего умеренного вируса с включением в его геном фрагментов ДНК животных. [c.626]

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды рВК322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген пронрпс в ядра и нормально в них реплицировался. [c.126]

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Выживает обычно от 10 до 30 % яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток, составляет от нескольких до 40 %. [c.127]

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют еще и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать на- [c.128]

Представления о роли метаболитов диазепама в предотвращении эпилептических припадков можно почерпнуть не только в опытах по антагонизму препарата с коразолом, но и при экспериментальной эпилепсии. Для этого вызывают у кошек эпилептогенные разряды внутрикортикальными микроинъекциями пеницилина О. Имек> щиеся данные [56] указывают на различный характер действия диазепама в условиях такого эксперимента. На острую эпилептическую активность существенное действие оказывают метаболиты диазепама и их концентрация в головном мозге и плазме крови. [c.169]

Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яй-цеклетюг — как правило, сразу после вьщеления. Часто вводимая трансгенная конструкция находится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей. [c.421]

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским проггуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулировать несколько сотен яйцеклеток. [c.421]

Рис. 19.3. Суммарная эффективность трансгеноза после микроинъекций. Все оплодотворенные яйцеклетки (100%) коровы, свиньи, овцы и мыши иноку-лировали трансгеном, однако успешная имплантация и появление потомства были редкими событиями трансгенное потомство давали менее 5% обработанных яйцеклеток.

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференци-ровке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (Е5). Е8-клет-ки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипо-тентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. [c.422]

Микроинъекция (Mi roinje tion) Введение в изолированную эукариотическую клетку ДНК или других молекул с помощью тонкой иглы. [c.553]

Впервые возможность переноса ДНК при помощи микроинъекций в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыщи была проиллюстрирована Дж. Гордоном и др. В этом эксперименте в несколько сотен оплодотворенных яйцеклеток инъецировали плазмидный вектор pBR322, содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) и часть генома обезьяньего вируса 40 (SV40). Из 78 потомков, рожденных приемными матерями, два содержали плазмидную ДНК. Авторы сделали вывод, что эти данные свидетельствуют о возможности использования рекомбинантных плазмид в качестве вектора для введения чужеродных генов непосредственно в эмбрионы мыщей, которые сохраняют эти гены в ходе развития . К сожалению, плаз- [c.428]

Трансгенньгх мышей получали микроинъекцией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток с помощью YA , несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных генов Р-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т. п. н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время - точно так же, как это происходит у человека. Такое соответст- [c.428]

Микроинъекцгш ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий - непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микроинъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками. [c.436]

Рис 69 Микроинъекция в ядро ооцита (1 — ооцит 2 — пигаентиро ванная половина 3 — микропипет ка 4 — ядро ооцита 5 — часть нейлоновой сетки для чашки Петри) [c.203]

По мере истощения природньгх рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области — создание рекомбинантных рыб путем трансгеноза. До настоящего времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зубатки, форели, лосося и т. д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке плохо различим в обычный микроскоп, линеаризованную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмбрионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необходимости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии. [c.438]

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности,с соматотропином, или гормоцом роста) оказались важными для животноводства (возрастание привесов животных, лактации) Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс-генных животных Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изучаются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме Схема получения, например, трансгенных мышей введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо приведена на рис 72 [c.209]

Недавно Кюн показал, что светоактивированный родопсин (идентичный метародопсину II) непосредственно взаимодействует с трансдуцином, образуя короткоживущий комплекс. Следовательно, запуск ферментативного каскада происходит непосредственно под действием активированного светом родопсина. Более того, внутриклеточная микроинъекция активированного трансдуцина в палочки моделирует действие света, т. е. гипер-поляризует клетки. Это свидетельствует о том, что активация каскада ферментов, участвующих в разложении GMP, играет основную роль в процессах преобразования света. Менее ясно, как взаимосвязаны светозависимые изменения метаболизма GMP и концентрации Са + и что за механизм или вещество регулирует в конечном итоге светозависимую проницаемость клеточной мембраны палочек. [c.18]

Метод микроинъекции используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные микроиглы (рис 69) Этот метод впервые продемонстрировали Дж Е Мерц и Дж Б Гердон в 1977 г на ооцитах лягушек Хепорив [c.203]

Для получения трансгенных животных, в частности — мышей, можно воспользоваться такими методами, как микроинъекции ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо, заражение предим-плантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, и, наконец, применение эмбриональных стволовых ES- или ЕК-кле-ток. [c.582]

Быстрота выполнения и надежность метода микроинъекций сделали его наиболее популярным среди специалистов-экспери-ментаторов. Используют различных линейных мышей, обеспеченных всем необходимым при хорошем их содержании в условиях вивария (животника). Обычно в опыт по микроинъекции берут не менее 20 гибридных самцов-производителей первого поколения (FI) в возрасте 8—12 месяцев, когда они характеризуются хорошей производительностью. При слабой или низкой активности самцов к подсаживаемым самкам их заменяют. Донорами оплодотворенных яйцеклеток выступают не менее 10 неполовозрелых (12—14 г) гибридных самок первого поколения (FI), подвергшихся суперовуляции и спариванию с гибридными самцами FI. Оплодотворенные одноклеточные яйца выделяют из операционно вскрытых яйцеводов самок-доноров спустя 12 часов после их спаривания с самцами-производителями. Выделенные яйца помещают в культуру на срок от 3 до 36 часов. От 10 самок можно получить 250 яиц, пригодных для микроинъекций. [c.582]

Отбирают яйцеклетки, переживших микроинъекцию ДНК, и вводят их в специальную микропипетку, с помощью которой привносят в яйцевод псевдобеременной мыши оплодотворенную яйцеклетку с включенной в нее клонированной ДНК. Часть пересаженных яиц погибает, а часть продолжает нормально развиваться. После этого естественным путем (или с помощью кесарева сечения) получают трансгенное потомство, идентифицируемое с помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геномной ДНК, изолированной из хвоста (отрезают кончик хвоста длиной примерно 1 см). [c.583]

Рис. 166. Схема получения трансгенных живо- организм выбрасы-тных методом микроинъекции ДНК в оплодотворен- вает 10 15 яйцеклеток ную одноклеточную яйцеклетку 1 - яйцеклетка, 2 - вместо ОДНОЙ В норме, микроишйкция ДНК, 3 - трансфекция ДНК, 4 - Все ЭТИ яйцеклетки ОП-пересадка ядра, 5 - пересадка клетки в бластоцисту. ,,

Если перед дроблением облучить задний полюс яйца ультрафиолетом, из таких янц развиваются стерильные особи, не имеющие половых клеток. Очевидно, это результат инактивации полярной плазмы стерильность можно предотвратить, если после облучения в яйцо инъецировать полярную плазму из необлученного яйца. Дополнительные эксперименты с микроинъекцией позволяют еще более четко продемонстрировать роль полярной плазмы в детерминации первичных половых клеток (рис. 15-41). Из заднего конца яйца-донора извлекают полярную плазму и инъецируют ее в передний конец другого яйца, где в норме образуются только соматические клетки. Это при-водиг к образованию клеток, по ввду сходных с полярными. Эти клетки переносят из второго зародыша в третий, с иным генотипом. Некоторые нз потомков мухи, развившейся из этого третьего эмбриона, имеют генотип [c.91]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология