Метод микроинъекций ДНК

Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных кле- [c.148]

Метод микроинъекций ДНК В настоягцее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем (рис. 19.2). [c.420]

Рис. 19.2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций. Яйцеклетки выделяют из са-мок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в суррогатную мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей трансгенных линий.

Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК (рис. 19.13). Процедура включала следующие основные этапы. [c.433]

Микроинъекции ДНК. В ряде экспериментов было показано, что метод микроинъекций может успешно применяться для трансформации растительных клеток аналогично микроинъекциям в животные клетки. Это стало возможным после преодоления ряда технических трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов для инъекций путем прикрепления их к стеклам полилизином. [c.61]

Изолированные из тканей растения или культивируемых клеток протопласты (см. гл. 2) после образования клеточной стенки являются идеальными отдельными клетками. До образования стенки их используют для переноса в клетку и (или) растение молекул (рекомбинантные ДНК), органелл, вирусов, бактериальных клеток, несущих генетическую информацию. При этом применяют различные методь микроинъекции, слияния с липосома-ми, в которые введены информационные макромолекулы, элект- [c.27]

Рис. 13.1. Схема методов микроинъекций (а) и прокалывания (б), обеспечивающих введение чужеродных молекул ДНК в клетки животных

В методе микроинъекции микрокапилляр подводят к каждой клетке микроманипулятором, затем прокалывают клетку и с помощью микрошприца вводят определенный объем раствора ДНК. Эта процедура трудоемка и требует относительно больших затрат времени. Метод прокалывания отличается тем, что микроигла находится в фиксированном положении, а каждая клетка подводится к ней перемещением предметного столика микроскопа. Фиксированным движением столика вверх-вниз клетка прокалывается. Данный метод по эффективности введения плазмидных молекул ДНК в клетки животных несколько уступает методу микроинъекции, но значительно превосходит его по простоте выполнения и производительности. [c.336]

Метод микроинъекции ДНК в ооциты в настоящее время наиболее популярен у исследователей, занятых получением трансгенных животных, несмотря на то, что он требует высокой квалификации и дорогостоящего оборудования. Это неудивительно — быстрота и надежность данного метода окупают все его недостатки. Первой и наиболее хорошо разработанной экспериментальной системой для получения трансгенных животных явилась мышь. [c.449]

Трансформацию животных клеток можно проводить не только за счет введения в них векторов, несущих чужеродный генетический материал, но и в результате микроинъекций целевых генов непосредственно в ядро животной клетки. Этот метод получил широкое распространение в последние годы. При помощи микрокапиллярной пипетки под микроскопом в ядро клетки вводится 10 —10 л раствора трансформирующей ДНК (несколько тысяч копий генов). [c.506]

С конца XIX века и до середины текущего столетия были разработаны методы пересадки эмбрионов от различных животных с последующим рождением полноценного потомства (клеточная инженерия). Следовательно, получение популяции, состоящей из генетически идентичных особей (клонирование), возможно не только с помощью рассмотренных выше трех способов (микроинъекций ДНК, вирусная инфекция и пересадка ES- и ЕК-клеток), но и с помощью пересадки эмбрионов, которая может быть [c.585]

Микроинъекции и электропорация бьши описаны в разд. 25.5.1. Эти методы можно использовать, однако они, по-видимому, менее эффективны, чем доставка нужных генов в клетки с помош ью вирусов и липосом. [c.264]

Микроинъекции - весьма эффективный и достаточно широко используемый метод, однако важно помнить, что в данном случае процедуре микроинъекции подвергается каждая клетка отдельно, поэтому количество клеток, которые можно наблюдать одновременно, ограничено. Существуют методы, позволяющие одновременно повышать проницаемость клеточных мембран у множества клеток, составляющих клеточные популяции. Для этого используют мощный электрический разряд или химическое воздействие, например, раствором детергента [c.199]

I. Краткая характеристика метода. Процесс получения трансгенных мышей с помощью микроинъекций схематически показан на рис. 10.2. Сущность каждого этапа экспериментальной схемы изложена ниже со ссылками на соответствующие разделы данной главы, где приводится более детальная информация [c.311]

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют еще и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать на- [c.128]

Вышесказанное можно проиллюстрировать следующими примерами. В США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отвечающий за экспрессию 3-лактоглобулина, который способен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбурге в 1992 г. были вьшедены трансгенные овцы с геном а-1-антитрипсина человека и 3-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомбинантных белков в системах с использованием культуры клеток составляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может повышаться до 1 л. Следует заметить, что создание клеточных культур и их выращивание в промышленных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их обслуживание — дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные легко размножа- [c.131]

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференци-ровке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (Е5). Е8-клет-ки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипо-тентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. [c.422]

Микроинъекцгш ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий - непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микроинъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками. [c.436]

Метод микроинъекции используют в случаях механического введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные микроиглы (рис 69) Этот метод впервые продемонстрировали Дж Е Мерц и Дж Б Гердон в 1977 г на ооцитах лягушек Хепорив [c.203]

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности,с соматотропином, или гормоцом роста) оказались важными для животноводства (возрастание привесов животных, лактации) Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых транс-генных животных Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изучаются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме Схема получения, например, трансгенных мышей введением клонированной ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо приведена на рис 72 [c.209]

Быстрота выполнения и надежность метода микроинъекций сделали его наиболее популярным среди специалистов-экспери-ментаторов. Используют различных линейных мышей, обеспеченных всем необходимым при хорошем их содержании в условиях вивария (животника). Обычно в опыт по микроинъекции берут не менее 20 гибридных самцов-производителей первого поколения (FI) в возрасте 8—12 месяцев, когда они характеризуются хорошей производительностью. При слабой или низкой активности самцов к подсаживаемым самкам их заменяют. Донорами оплодотворенных яйцеклеток выступают не менее 10 неполовозрелых (12—14 г) гибридных самок первого поколения (FI), подвергшихся суперовуляции и спариванию с гибридными самцами FI. Оплодотворенные одноклеточные яйца выделяют из операционно вскрытых яйцеводов самок-доноров спустя 12 часов после их спаривания с самцами-производителями. Выделенные яйца помещают в культуру на срок от 3 до 36 часов. От 10 самок можно получить 250 яиц, пригодных для микроинъекций. [c.582]

Рис. 166. Схема получения трансгенных живо- организм выбрасы-тных методом микроинъекции ДНК в оплодотворен- вает 10 15 яйцеклеток ную одноклеточную яйцеклетку 1 - яйцеклетка, 2 - вместо ОДНОЙ В норме, микроишйкция ДНК, 3 - трансфекция ДНК, 4 - Все ЭТИ яйцеклетки ОП-пересадка ядра, 5 - пересадка клетки в бластоцисту. ,,

При определении с помощью индикаторов восстановительной способности клеток ярименяются два метода. Краситель или вводится в клетку микроинъекцией, или же красителю дают диффундировать в клетку. Метод микроинъекции не может применяться, если клетки малы или ч увствительны к повреждению. При применении диффузионного метода надо быть уверенным, что индикатор будет проникать в клетку. В табл. 26 приведены наиболее обычные индикаторы, которые могут с пользой применяться при ооотвегствующих условиях. [c.176]

Д ля образования трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких трансгенных животных (трансгенные особи, родившиеся из инъецированных эмбрионов), все или, по крайней мере, часть половых клеток которых содержат трансген. При исследовании родившихся животных и полученного от них потомства было показано, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях (в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток), могут появляться мозаики. Мозаиками считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющих различные генотипы. Трансгенные мозаики кроме клеточных линий, содержащих трансген, имеют нетрансгенные линии. При получении от таких животных трансгенного потомства и при выделении трансгенных линий могут возникнуть трудности. Так, если клетки гонад не содержат трансген, потомство не может наследовать инъецированный ген от трансгенной родительской формы. На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками (Wilki Т.М. е1 а ., 1986). Поэтому трансген не передается потомству с ожидаемой согласно закону Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. [c.228]

Имеются убедительные свидетельства того, что снижение активности А-киназы является необходимым и достаточным условием для запуска программы созревания ооцита. Микроипъекции каталитически активного фрагмента киназы, активного в отсутствие циклического АМР (см. разд. 12.4.2), ингибируют созревание, индуцируемое прогестероном, тогда как микроинъекции снецифического ингибитора киназы инициируют созревание даже при отсутствии прогестерона. Эксперименты на мышиных ооцитах, проводившиеся гакже с помощью метода микроинъекций, показали, что у млекопитающих действует аналогичный внутриклеточный механизм передачи сигналов. Субстраты А-киназы нока не выявлены, однако полагают, что ими могут быть фосфонротеины, входящие в систему прерывания мейотического деления I, ответственную за задержку ооцита в профазе 1. По имеющейся гипотезе. [c.32]

Улучшение методов микроинъекций и микрокультивирования или использование систем оплодотворения in vitro в будущем позволит получать растения из подвергшихся микроинъекциям незрелых и зрелых гамет, зигот или ранних зародышей. [c.202]

Несмотря на описанные выше проблемы в разработке методов микроинъекций для растительных клеток, особенно протопластов, достигнут большой прогресс. В ранних исследованиях проводили инъекции в цитоплазму протопластов табака при 70%-ной выживаемости [40]. В этих экспериментах использовали клетки двух-, трехдневного возраста, полученные из протопластов, которые сформировали тонкую клеточную стенку и способны прикрепляться к покровному стеклу, покрытому по-ли-Ь-лизином (рис. 3.7,Л). За микроинъекцией наблюдали вводя флуоресцентный краситель (Lu ifer yellow). Однако игла микроинъектора редко попадала в ядро из-за того, что при использовании этого метода иммобилизации протопластов/клеток трудно локализовать ядра. С тех пор сообщалось, что поли-L-лизин часто обладает токсическим действием по отношению к протопластам. [c.223]

В оплодотворенные яйца животных вводили ДНК методом миКроинъекции и имплантировали эти яйца в половые пути псевдобеременных самок (Gordon et al., 1980). С помощью такого внедрения чужеродного гибридного гена в зачатковые клетки были получены гигантские мыши. Промотор гена ме-таллотионеин-1 мыши был слит со структурным геном гормона роста крысы и введен методом микроинъекции в мышиные яйца. Рост мышей резко усиливался. Чужеродная ДНК включалась в хромосомы мыши и передавалась через клетки зародышевой линии (Palmiter et al., 1982). [c.304]

Форма клетки зависит от находящихся в данный момент в полимеризованном состоянии элементов цитоскелета. Существуют два экспериментальных подхода к исследованию сборки интерфазного цитоскелета, но каждый из них имеет свои ограничения. Один состоит в том, что в клетки вводится путем микроинъекции флуоресцентно меченный белок, способный участвовать в сборке цитоскелетных структур in vitro [182—186]. Внутриклеточная локализация этого белка изучается затем с помощью световой микроскопии. Структуры, идентифицированные таким образом, почти никогда не бывают артефактом, поскольку они выявляются также методом иммунофлуоресценции. Метод микроинъекций страдает некоторыми недостатками. С его помощью можно идентифицировать только такие цитоскелетные структуры, у которых происходит обмен мономерами с растворимой фазой. Стабильные структуры, у которых не происходит заметного обмена в течение нескольких часов, таким методом выявить нельзя. Метод микроинъекций не позволяет также различить процессы сборки и обмена. После инъекции сначала видна диффузная флуоресценция, которая затем локализуется в определенных точках такая картина равно согласуется и с предположением о том, что происходит сборка структур, способных к обмену, и с предположением о том, что инъецированный белок связывается с ограниченным числом связывающих участков. Различать эти возможности позволяет изучение кинетики процесса. Еще один недостаток рассматриваемого метода состоит в том, что на флуоресцентной картине размеры структур кажутся увеличенными по сравнению с действительными. Относительно результатов, получаемых данным методом, заметим также следующее 1) выявляемые им структуры, как правило, не являются артефактом 2) скорость, с которой выявляются структуры в опыте, отличается от скорости их формирования в клетке 3) в некоторых случаях наблюдаемая картина зависит от типа клеток [184] 4) определенное для микротрубочек направление сборки согласуется с тем фактом, что их быстро растущий конец является дистальным 5) наиболее подвижная форма актина, которую можно обнаружить в клетках [c.99]

Микроинъекция вирусных молекул ДНК. А. Грессман (1970 г) для введения молекул ДНК в культивируемые клетки млекопитающих предложил использовать метод микроинъекции. Процедура заключается во введении в клетку (цитоплазму или ядро) малых объемов жидкости (около 10 мкл) с помощью стеклянного микрокапилляра (рис. 13.1). Эксперимент проводится на предметном столике микроскопа с применением микроманипуляторов и микрошприцев. Используя эту методику, удалось изучить биологическую активность молекул ДНК разных вирусов. К достоинствам метода относится то, что определенное количество препарата ДНК можно ввести в выбранную область клетки, в частности в ядро. Недостатком метода является его сложность и невысокая производительность. Кроме того, по-видимому, он применим лишь к небольшим молекулам ДНК, так как при продавливании через микрокапилляр целостность больших молекул ДНК будет нарушаться вследствие гидродинамического сдвига. В силу отмеченных недостатков метод микроинъекции при анализе инфекционности вирусных ДНК используется крайне редко. [c.334]

В 1980 г. М. Капекчи применил метод микроинъекции для введения плазмидной ДНК в клетки млекопитающих. При инъекции в ядра мышиных клеток L ТК плазмиды pBR322, содержащей встроенный ген тимидинкиназы вируса герпеса, в 50-100 % выросших клеточных клонов выявлялась ферментативная активность тимидинкиназы. Если данную плазмиду вводили в цитоплазму клеток, доля клонов, в которых выявлялась экспрессия гена tk, бьша значительно меньше. Это прежде всего доказывает, что ген вируса герпеса экспрессируется в ядре клетки и, кроме того, что ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для проникновения чужеродной ДНК в ядро клетки. [c.336]

Интересную модификацию метода микроинъекции, названную методом прокалывания, разработали Ф. Ямамото с соавторами (1981 г.). Вместо микропипетки используется микроигла. Монослой клеток заливают раствором, содержащим молекулы ДНК, которые хотят ввести в клетки. Клетки прокалывают стеклянной мик-роигаой, и раствор с молекулами ДНК попадает в клетки (см. рис. 13.1, б). Плазмиды, несущие ген тимидинкиназы вируса герпеса, при введении данным методом проникали в 25 % клеток. [c.336]

Получение трансгенных животных предусматривает ряд этапов приготовление раствора ДНК для микроинъекции извлечение эмбрионов из донорных организмов микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов. У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем использования традиционных методов разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекхщонного раствора ДНК [c.127]

Для получения трансгенных животных, в частности — мышей, можно воспользоваться такими методами, как микроинъекции ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо, заражение предим-плантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, и, наконец, применение эмбриональных стволовых ES- или ЕК-кле-ток. [c.582]

Клеточная память играет чрезвычайно важную роль, и именно по этой причине поведение клеток в определенное время зависит от того выбора, что был сделан ее предками в предыдущих циклах деления. Таким образом, для полного понимания всей программы развития необходимо знать, как осуществлялись клеточные деления, т.е. необходимо знать генеалогию индивидуальных клеток эмбриона. В этом и состоит сущность генеалогического анализа, проведение которого, особенно на примере крупных и сложно организованных животных (например, позвоночных), представляет собой довольно трудную задачу. Если на ранних стадиях развития специфически пометить отдельные клетки, то на более поздних стадиях можно идентифицировать сами клетки или их потомки. Один из способов мечения заключается в микроинъекции специфических молекул, за которыми легко следить (нанример, флуоресцирующие красители или фермент пероксидазу хрена см. разд.. 19.1.5), в клетки ранних эмбрионов (рис. 16-29). Кроме того, отдельные клетки эмбриона можно пометить генетически, нанример, создавая условия для их инфекции специально выбранным ретро-вирусом (см. разд. 17.5.4) или подвергая эмбрионы действию ионизирующего излучения, вызываюшего случайные соматические мутации (см. разд. 16.5.13). Эти методы генеалогического анализа весьма трудоемки и каждый из экспериментов дает лишь небольшую информацию [c.85]

III. Эффективность микроинъекционного метода. Эффектна иость процедуры получения трансгенных мышей путем микроинъекций сильно варьирует от эксперимента к эксперименту. В оптимальных условиях 60—80% яиц переживает инъекцию. Из них 10—30% имплантируется в организм реципиентной самки, продолжает нормально развиваться и дает начало потомству. 10—30% новорожденных мышей оказываются трансгенными. В какой-то степени успех эксперимента зависит от превходящих условий, например от сноровки экспериментатора. Однако определяющее значение здесь имеют качество инъецируемой ДНК (разд. 10.4.1) и выбор линии мышей (разд. 10.2.2.1) поэтому эти два параметра следует строго контролировать. [c.313]

Одно из преимуществ описываемой процедуры получения трансгенных мышей по сравнению с другими методами состоит в том, что любую клонированную ДНК (в лямбоидном, плазмидном или космидном векторе) можно ввести в зиготу, где она интегрируется в геном и оказывается включенной в формирование зародышевого пути. Дополнительные манипуляции, такие, как переклонирование в специальные векторы и получение вирусных препаратов, здесь не требуются. Следует, однако, подчеркнуть, что эффективность микроинъекции в большой степени зависит от качества и свойств вводимой ДНК [15J. Ниже мы рассмотрим этот вопрос подробнее. [c.341]

ДНК для микроинъекций можно выделять из космидных или плазмидных клонов любым стандартным методом, например, используя обработку бактериальной массы лизоцимом и тритоном Х-100 или же лизируя бактерии щелочью и далее отделяя сверхспирализованные молекулы в градиенте плотности s l в присутствии бромида этидия [26]. Процедура получения высококачественной плазмидной ДНК, не требующая ультрацептрифугировапия [27], приведена в табл. 10.9. [c.343]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология