Рестриктаза

В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами — обширным классом ферментов, представители которого различаются по механизму действия и специфичности (табл. 1), Среди нуклеаз, приведенных в таблице, нужно особо выделить эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). ферменты (их функции рассмотрены в гл. VI) узнают в молекулах ДНК не отдельные нуклеотидные остатки, а нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют любую ДНК на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов. [c.13]

Широкое распространение обмена ДНК между бактериями ставит перед ними задачу сохранения собственного генома. Далеко не всегда проникшая в клетку чужеродная ДНК.способна оказаться полезной. Более того, посторонний генетический материал может быть губительным для клетки, особенно если принадлежит бактериальному вирусу, бактериофагу. Для того чтобы бороться с чужеродной ДНК, нужно уметь отличать свою ДНК от чужой. Бактерии достигают этого те.м, что метят свою ДНК с помощью специального модифицирующего фермента. Практически все виды бактерий имеют метилазы, модифицирующие аденин или цитозин в определенной, характерной для данного вида последовательности ДНК- Другой специальный фермент, эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза), узнает ту же последовательность и разрезает ее, если она не модифицирована, т. е. попала в клетку извне. Таким путем бактерии ограничивают возможности попадания в них постороннего генетического материала. [c.129]

II типа с разной специфичностью (разными сайтами рестрикции). В результате сейчас известно более 350 рестриктаз разных бакте- [c.130]

Таб.шца 7 Некоторые рестриктазы второго типа [c.131]

Подобная сложность систем рестрикции I типа привела к предположению о том, что эти ферменты играют в клетках какую-то роль помимо рестрикции. Однако другие функции рестриктаз пока не обнаружены. [c.132]

Рестриктазы III типа являются промежуточными между ферментами 1 и II типов. Подобно ферментам 1 типа, в состав единого фермента III типа входят и рестриктаза, и метилаза. Рестриктазы [c.132]

III типа вносят разрыв не в сайт узнавания, но в отличие от рестриктаз I типа на небольшом фиксированном расстоянии от него. [c.132]

Защита собственного генетического материала с помощью системы рестрикции не всегда эффективна, о чем свидетельствует само существование бактериальных вирусов — бактериофагов. Оказывается, бактериофаги выработали разнообразные тактики борьбы с рестрикцией. Например, для сравнительно небольших фагов известны случаи, когда жесткий отбор на преодоление рестрикции привел к полному отсутствию сайтов узнавания рестриктазы хозяина на фаговой ДНК. Другой способ борьбы с рестрикцией используют некоторые крупные бактериофаги. В состав нх ДНК входит необычное основание, например в ДНК Т-четных фагов Е. соИ [c.132]

Д. содержатся в ядрах, митохондриях и лизосомах всех клеток. Участвуют в репликации (копировании) ДНК, образовании новых сочетаний генов и в ликвидации повреждений генетич. структур. Препятствуют проникновению чужеродной ДНК в организм. Мн. Д., особенно рестриктазы, применяют для лаб. исследований, Д. из поджелудочной железы крупного рогатого скота-для лечения вирусных заболеваний, напр, катара верх, дыхат. путей. [c.14]

Рестриктазы незаменимы в структурных исследованиях нуклеиновых кислот. В случае РНК достаточно специфическое расщепление ее цепи можно осуществить с помощью рибонуклеазы Н, гидролизующей полирибонуклеотиды только в ДНК — РИК-гибридах. Для этого с участком РНК, предназначенным для расщепления, предварительно связывают комплементарный ему олигодезоксири-бонуклеотид и обрабатывают образовавшийся комплекс РНК-азой Н (рнс. 4). [c.15]

Современные методы определения нуклеотидной последовательности ДНК позволяют в одном эксперименте просеквенировать (от англ. sequen e — последовательность) ее фрагмент длиной в 150—300 нуклеотидных остатков (и.о.). Поэтому исходная молекула ДНК предварительно фрагментируется. Для этого чаще всего ДНК гидролизуют рестриктазами (причем проводится независимое расщепление двумя рестриктазами или более, в результате чего образуются перекрывающиеся фрагменты (рис. 5). Это позволяет после определения нуклеотидной последовательности соответствующих фрагментов реконструировать первичную структуру всей [c.15]

Рис. 5. Расщепление рестриктазами крупного сегмента гена Р-цепи глобина кролика с образованием перекрывающихся фрагментов Секвенированне фрагмента 4, получаемого совместным действием рестриктаз Нае III К Нра 1. позволяет однозначно расположить друг относктельно Друга фрагменты I Н 2

Системы рестрикции II типа обнаружены у очень многих бактерий. Эти системы состоят из двух отдельных ферментов, рестриктазы н метилазы, узнающих одну и ту же последовательность ДНК — сайт рестрикции. Если сайт рестрикции не метилирован, то рестриктаза вносит в него двуцепочечный разрыв. ДНК не подвергается рестрикции, если хотя бы одна цепь метилирована. Такие свойства предохраняют собственную ДНК бактерий от рестрикции собственная ДНК либо полностью метилирована по всем сайтам рестрикции, либо, после репликации, патуметилирована. На полуметилированные сайты рестрикции действует метилаза и метилирует их полностью. Как и прочие клеточные метилазы, метилазы системы рестрикции-модификации в качестве донора метильных групп нс-патьзуют 5-аденозилметионин. В табл. 7 для примера приведены данные о некоторых рестриктазах и метилазах II типа. [c.130]

Сайт рестрикции рестриктаз II типа, как правило, симметричен обе цепи ДНК и.меют одинаковую последовательность, если читать ее в одном и том же направлении (например, от 5 - к З -концу ДНК) для каждой цепи (табл. 7). Эго естественно, поскатьку рестриктазы вносят разрывы в обе цепи ДНК и метилазы тоже метилируют обе цепи. [c.130]

Рестриктазы II типа очень широко испатьзуются в методах генной инженерии для физического картирования ДНК и для выделения участков ДНК в составе того или иного рестрикционного фрагмента. Поэтому в течение ряда лет велся широкий поиск рестриктаз [c.130]

TGA. TG T=3 . Если оба отмеченных звездочкой аденина этой последовательности метилированы, то рестриктаза ничего с последовательностью не делает. Если метилирован только один аденин (например, после репликации нлн репарации), то метилаза метилирует второй, используя S-аденозилметионин в качестве донора метильной группы. Если же сайт не. метилирован, то ДНК. в составе [c.131]

Естественно, что еще более эффективную, чем с гепарином, и избирательную очистку белков метаболизма и регуляции матричной активности можно получить, используя в качестве лигандов сами нуклеиновые кислоты. Аффинные сорбенты с иммобилизованными НК могут обладать не только групповой (белки хроматина, нуклеазы, рестриктазы и др.), но и сугубо индивидуальной снецифично- [c.370]

Выбранный фрагмент ДНК (в данном случае из генома дрозофилы) встраивали в плазмиду, которую отбирали, размножали и очищали методами генной инженерии (1). Затем ее линеаризировали обработкой рестриктазой, не затрагивающей встроенный фрагмент (2). После этого с помощью ограниченного гидролиза экзо-нуклеазой III (30 мин при 0°) удаляли с З -концов каждой из нитей около 300 оснований (3). Обработанную таким образом ДНК сажали на активированную по методу Нойеса и Старка (см. выше) л-амино-бензилоксиметилцеллюлозу. Ковалентное присоединение происходило по однопитевым концам молекулы (через Се гуаниловых остатков). Так получали сорбент с экспонированными, заранее выбранными фрагментами двунитевой ДНК (4). [c.425]

Принцип метода иллюстрирует рис. 148. Фрагмент ДНК, по которому ведется отбор, например содержащий определенный ген, встраивают и размножают в плазмиде. Очищенные плазмиды дробят ультразвуком или линеаризируют действием рестриктаз, а затем меркурируют, как описано выше. Фрагментированные ДНК или РНК, из которых надлежит отобрать комплементарные участки, гибридизуют с ДНК меркурированных плазмид в условиях, когда последняя находится в избытке. Гибридные молекулы (вместе с молекулами ренатурпрованной плазмидной ДНК) вносят на колонку SH-сефарозы. При этом нити плазмидной ДНК через атомы ртути ковалентно связываются с сорбентом (на рис. 148 для ясности он изображен в виде ааштрихованных полосок у стенок колонки, тогда как в действительности он заполняет весь ее объем). Промывка колонки удаляет из нее не вошедшие в состав гибридов, т. е. пе комплементарные к плазмидной ДНК фрагменты нуклеиновых кислот. Затем следует элюция 97 %-ным формамидом нри повышенной темнературе. Двунитевые структуры диссоциируют, и очищенные комплементарные участки ДНК или РНК, не будучи связанными с матрицей, выходят из колонки. Остающуюся в колонке меркурированную плазмидную ДНК можно снять, как обычно, элюцией -меркаито-этанолом. [c.438]

Описанный подход люжно использовать и для очистки рестриктов ДНК, содержащих определенную последовательность, из продуктов переваривания рестриктазами суммарных нативных ДНК или для оценки содержания определенных генов в исследуемой ДНК путем титрования избытком меченой кДНК. Авторы отмечают, что аналогичные задачи решались путем гибридизации с НК, сорбированными на целлюлозе. Однако гибридизация с участием иммобилизованных НК идет хуже, а при последующем плавлении гибридов с матрицы могут частично сниматься и пе закрепленные ковалентной связью молекулы, по которым идет отбор. [c.439]

Расщепление нуклеиновых кислот под влклнием специфических ферментов — эндо- и экзонуклеаз — сопровождается разрывом фосфо-диэфирной связи и образованием продуктов различной величины, которые могут быть разделены методами электрофореза и хроматографии. Это широко используется при анализе последовательности нуклеотидов в молекулах РНК и ДНК., Особое значение при развитии генной инженерии получило расщепление ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами), позволяющее получать отрезки ДНК определенной длины и нуклеотидного состава. > [c.175]

При полном расщеплении ДНК фага X рестриктазой Hind П1 образуются фрагменты, содержащие 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 и 165 пар оснований они могут быть разделены с помощью электрофореза в геле агарозы. [c.175]

Получение рестриктов ДНК фага X. 2 мкг ДНК фага % растворяют в 20 мкл раствора № 1, добавляют рестриктазу Hind III (2— [c.175]

Интенсивность окраски бромистым этидием зависит от размеров рестриктов зоны крупных рестриктов удается выявить при наличии 30—50 нг в полосе. Для выявления мелких рестриктов необходимо иметь 200—500 нг фрагмента ДНК в каждой полосе. Поэтому для обнаружения всех фрагментов, образующихся при обработке ДНК фага "К рестриктазой Hind П1, необходимо наносить на гель образцы с минимальным (0,3—0,5 мкг) и максимальным (2—5 мкг) количеством ДНК. В последнем случае удается выявить все зоны рестриктов, при этом полосы крупных рестриктов выявляются в виде сильно перегруженных зон, а полосы средних и мелких по размеру рестриктов — в виде тонких, четко разделенных полос. [c.176]

Представление о том, что носителем генетич. информации является ДНК, возникло еще в 1944. Было известно также, что ген представляет собой отрезок ДНК, кодирующий определенный белок, и что передача наследств. ин(]юр-мации между поколениями происходит посредством удвоения молекул ДНК. Но любым манипуляциям препятствовала огромная молекулярная масса ДНК, составляющая миллионы и миллиарды иа клетку, и невозможность получать химически однородные небольшие ее фрагменты. Положение изменилось, когда удалось обнаружить и выделить два рода ферментов 1) рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)-они рассекают молекулы ДНК в пределах строго определенных нуклеотидных последовательностей их описано ок. 400, наиб, употребительны рестриктазы E o RI, Hind III, Bam HI, Pst I, Sal I и др. 2) ДНК-лигазы (прежде всего фермент кишечной палочки, индуцируемый бактериофагом Т4), к-рые сшивают двухцепочечные фрагменты ДНК, восстанавливая межнуклеотндные связи в местак единичных разрывов. С помощью этих ферментов получают удобные для генетич. операций фрагменты ДНК и соединяют их в единое целое. Для такого объединения безразлично происхождение ДНК (химически у всех существ она одинакова), между тем в природе объединению генетич. информации неродственных существ препятствуют разл. межвидовые барьеры. [c.518]

РЕСТРИКТАЗЫ (эндодезоксирибонуклеазы рестрикции), Арменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических (бактерии и синезеленые водоросли) и иек-рых др. организмах и выполняющие тем самым иммунную ф-цию. [c.259]

Функционирование систем Р. и м. ДНК (сокращенно Р.) основано на след, принципах. С помощью рментативных р-ций собств. клеточная ДНК специфич. образом модифицируется так, что рестриктазы оказываются по отношению к этой ДНК неактивными. Любая вторгающаяся в клетку чужеродная ДНК отличается от резидентной (собственной) ДНК по специфичности модификации. Это делает чужеродную ДНК чувствительной к действшо рестриктаз - разрушению ( рестрикщш ) подвергаются те молекулы ДНК, к-рые не содержат соответствующих модифицир. элементов. [c.259]

Р. осуществляются только в отношении двухдепочечных молекул ДНК. Одноцепочечщ.1е ДНК нек-рых фагов модифицируются или подвергаются рестрикции только тогда, когда они находятся в фазе репликации. В то же время для обеспечения устойчивости к рестриктазам достаточно модификации только одной из цепей ДНК. По этой причине ДНК, образующаяся в ходе полуконсервативной репликации, защищена от действия собств. клеточных рестриктаз благодаря модификации матричной цехш. [c.259]

Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (1990) -- [ c.13 , c.16 , c.129 , c.133 , c.225 , c.248 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.13 , c.16 , c.129 , c.133 , c.225 , c.248 ]

Органическая химия (2001) -- [ c.562 ]

Методы общей бактериологии Т.3 (1984) -- [ c.142 , c.145 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология