Три типа эндонуклеаз рестрикции

Что такое эндонуклеазы рестрикции типа II и почему они так важны для технологии рекомбинантных ДНК [c.79]

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Сейчас известно, что рестрикция связана с расщеплением фаговой ДНК эндонуклеазой, специфически узнающей определенную последовательность нуклеотидов, а модификация состоит в метилировании той же последовательности. Различают системы рестрикции и модификации 1, 11 и III типа. [c.130]

В дальнейшем выяснилось, что один и тот же штамм может осуществлять несколько типов рестрикции и модификации. Из клеток, способных к рестрикции, были выделены эндонуклеазы, специфичные к определенным нуклеотидным последовательностям неадекватно модифицированной ДНК. Эти ферменты широко применяются в работах по генной инженерии (см. гл. 11). [c.222]

В системах рестрикции-модификации типа III субъединица ДНК-метилтрансферазы (Mod) распознает асимметричный сайт рестрикции (рис. 2) [76]. Эндонуклеаза (Res) может выполнять свои функции только в комплексе с Mod-субъединицей, причем [c.50]

История открытия ферментов рестрикции, детальная характеристика их биологической роли, энзиматических и структурных особенностей детально рассмотрена в большом количестве обзоров [49, 58, 59, 62, 263, 309, 417]. Учитывая направленность настоящего обзора на рассмотрение одного из известных типов рестриктаз, в этом его разделе ограничимся лишь описанием некоторых общих вопросов, призванных в первую очередь определить место специфических эндонуклеаз (рестриктаз II типа) среди других обсуждаемых ферментов. [c.6]

Из различных видов и щтаммов бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной спирали ДНК. В таблице 9.2 приведена их классификация. Функция некоторых из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клетки от присутствия чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они, по-видимому, не ограничивают проникновение чужеродной ДНК in vivo. Вероятно, эти ферменты осуществляют какие-то иные функции. Как бы то ни было, рестриктазы независимо от их функций in vivo служат мощным инструментом структурного анализа геномов. [c.270]

Системы рестрикции-модификации типа II устроены наиболее просто [74, 75]. В таких системах модифицирующая ДНК-ме-тилтрансфераза функционирует в виде свободного мономера, а эндонуклеаза рестрикции - в виде димера, причем эти два фермента не зависят друг от друга. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, они активны в присутствии ионов Mg2+ без каких-либо дополнительных кофакторов и чаще всего используются при молекулярном клонировании, а также в ДНК-диагностике. [c.50]

Среди охарактеризованных специфических эндонуклеаз рестрикции также имеется группа ферментов, узнающих несимметричные последовательности нуклеотидов (табл. 8, типы 34—37). Эти участки по своей струк1уре напоминают последовательности, узнаваемые рестриктазами III типа (см. табл. 1). Всего идентифицировано 58 таких ферментов, узнающих 22 различных последовательностей. [c.40]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Как и в случае фага X, путем различных модификаций генома фага М13 дикого типа (рис. 5.16) были сконструированы разные удобные векторы. Для получения рекомбинантов использовались двухцепочечные репликативные формы, о которых говорилось выще. Одноцепочечные молекулы ДНК не применяют в качестве векторов, поскольку обычно их нельзя разрезать с помощью эндонуклеаз рестрикции типа II. Большая часть генома, состоящего примерно из 6400 нуклеотидных остатков, содержит гены, кодирующие белки оболочки, а также белки, участвующие в репликации и сборюг. Область начала репликации состоит примерно из 150 нуклеотидов, находящихся внутри некодирующего сегмента длиной 507 нуклеотидов. В этот сегмент может бьпь помещена вставка без нарущения способности М13 к репликации. [c.243]

Интересно, что этот короткий участок ДНК, метилированный или неметилиро-ванный, обладает внутренней симметрией относительно центральной точки, показанной красным цветом. Если повернуть этот участок на 180° в плоскости рисунка вокруг центральной точки, то он будет читаться точно так же, как до поворота. Такой тип симметрии характеризуется осью симметрии второго порядка. Больщинство проверенных последовательностей модификации-рестрикции обладают симметрией второго порядка. Рестриктирующая эндонуклеаза Hind II расщепляет обе цепи в середине этого участка в любой ДНК, в которой эта последовательность не метилирована. Будучи расщепленной таким образом, чужеродная ДНК не может быть исправлена и поэтому не может реплицироваться. [c.880]

Системы модификации и рестрикции были открыты благодаря их действию в отношении инфицирующей фаговой ДНК. Фаговая ДНК, выделяемая из бактерии, может успешно инфицировать другую бактерию того же штамма, поскольку обе клетки имеют один и тот же тип модификации. Однако фаговая ДНК, которая переходит из одного штамма в другой, атакуется рестрикционными эндонуклеазами. Следовательно, фаг ограничен (restri ted) одним бактериальным штаммом, отсюда и появился термин рестрикция . Следует отметить, что рестрикция не обязательна. Некоторые инфицирующие фаги избегают ее, что обусловлено либо мутациями в сайтах-мишенях, либо неточной раВотой системы клетки-хозяина. В этом случае они приобретают тип модификации нового хозяина. [c.432]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Становление генной инженерии связано с открытием и использованием специального класса ферментов — специфических эндонуклеаз, или рестриктаз. Ферменты этого типа являются составной частью системы рестрикции — модификации прокариотических клеток. Разл.1чают три основных класса рестриктаз [c.139]

Большинство рестриктаз класса II узнают на ДНК последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, обладающих осью симметрии второго порядка. В 1973 г. американские И1-следователи X. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру для обозначения ферментов системы рестрикции — модификации. В соответствии с этой номенклатурой, которая сегодня является общепринятой, первая буква рода и две первые буквы вида образуют состоящие из трех букв сокращения источника выделения фермента. Эндонуклеазы обозначают символом R, метилазы — М. Если из одного типа клеток выделены два или больше ферментов рестрикции, то их нумеруют соответственно римскими цифрами. Исходя из этой номенклатуры рестриктазы Е. oli [c.139]

Системы рестрикции-модификации типа IV распознают асимметричные последовательности, отступя от которых на определенные расстояния, делают разрезы ДНК, что сближает их с системой IIS (см. ниже и рис. 2) [77]. Однако, в отличие от IIS, в системе типа IV эндонуклеазная и ДНК-метилтрансферазная активности находятся в составе одной полипептидной цепи, а эндонуклеазная активность стимулируется S-аденозилметионином. Эта метилтрансфераза метилирует лишь одну цепь ДНК, чего недостаточно для подавления рестрикции в данном сайте. В системе типа IV обнаружена вторая метилтрансфераза, которая метилирует обе цепи ДНК, что делает сайт устойчивым к соответствующей эндонуклеазе. [c.51]

На основании субъединичной структуры и потребности в кофакторах рестриктазы сначала были разделены на два типа [89]. В результате дальнейших исследований появились дополнительные критерии для классификации ферментов рестрикции. Был идентифицирован третий тип специфических эндонуклеаз [201, 307]. Основные свойства ферментов всех трех типов приведены в табл. 1, позаимствованной из обзора Юана [417]. Эта таблица представлена с незначительными дополнениями, касающимися новых сведений о субстратной специфичности сравниваемых ферментов рестрикции, отнесенных к разным типам [212, 292, 293, 319]. Включение в нее данных о модифицирующих метилазах является неизбежным, так как ферменты I и III типов представляют собой бифункциональные сложные белки, проявляющие как рестриктазную, так и ме-тилазную активность [157, 201, 307, 325, 418]. Кроме того, ферменты I типа обладают ярко выраженной АТФазной активностью [134, 418]. [c.8]

По ряду причин, которые будут рассмотрены ниже, биологический подход, в отличие от биохимического, для целенаправленного поиска продуцентов специфических эндонуклеаз за редкими исключениями не применялся и их выявление оказалось как бы побочным продуктом исследований, посвященных отдельным аспектам поиска и изучения СХС. Среди таких исследований, имевших различные первоначальные цели, предшествовавших открытию рестрикционных эндонуклеаз П типа, находим эксперименты, посвященные изучению распространению и характеристики СХС в различных таксономических группах микроорганизмов [24, 25, 186, 242], механизмов ограничения развития фагов R плазмидами [8, 129, 300] и факторов, влияющих на исход опытов по фаготинированщо [258]. В некоторых случаях первопричиной таких опытов было стремление выбрать не обладающие СХС базовые штаммы некоторых новых объектов с целью их использования как реципиентов рекомбинантных молекул ДНК в опытах по генетической инженерии. Примером таких работ является изучение наличия и специфичности систем рестрикции—модификации в штаммах стрептомицетов [6] и цианобактерий [91]. [c.131]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология