Фосфодиэстераза

Первая стадия. На первой стадии реакции фосфодиэстераза гидролизует 3, 5 -цАМФ до АМФ (6). Реакцию проводят в инкубационной среде, состоящей из 50 мМ трис-НС1 (pH 7,0), 10 мМ ацетата магния, цАМФ как субстрата реакции (концентрацию цАМФ выбирают в зависимости от целей эксперимента) и 0,3—0,4 мкКи ( Н)-цАМФ для определения скорости реакции по изменению концентрации радиоактивного изотопа в пробе. Дополнительно в соответствии с поставленной задачей инкубационная среда может содержать ЭГТА для определения активности фосфодиэстеразы свободной от кальмодулина или Са + и кальмодулина для активации фермента, различные комбинации концентрации Са +, кальмодулина и его антагонистов для определения действия последних на комплексе Са +—КМ—ФДЭ. [c.381]

Фосфодиэстераза характеризуется наличием аллостерического центра, взаимодействующего с молекулой кальмодулина (КМ) в присутствии Са . Кальмодулин принято считать универсальным белковым модулятором. Число известных ферментов, подверженных его активирующему действию, довольно велико и продолжает расти. Показано, что кальмодулин, связывая Са +, претерпевает конформационные изменения, приобретая основное свойство — активировать фермент — мишень. Интегральная концентрация кальмодулина в клетке достаточно велика (1 —10 мкМ), поэтому его модулирующие свойства определены внутриклеточной концентрацией Са +. Взаимодействие Са +, кальмодулина и фосфодиэстеразы в первом приближении описывается следующей упрощенной схемой [c.378]

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКИХ 5 [c.377]

Определение активности фосфодиэстеразы [c.380]

Цель работы — изучение регуляции фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов из мозга крупного рогатого скота при действии кальмодулина. [c.379]

Активность фосфодиэстеразы определяют по двустадийной методике Томпсона с применением меченного по тритию цАМФ, в основе которой лежит двухступенчатая реакция [c.380]

Теперь мы обратимся к краткому рассмотрению того, как описанные фотохимические изменения превраш,аются в электрический импульс, который стимулирует мозг. Существуют доказательства, что одиночный квант света может вызвать раздражение палочки сетчатки. Однако поглощение одного кванта еще не создает эффекта зрения. Для этого требуется попадание нескольких квантов (согласно разумной оценке, от двух до шести квантов) в одну и ту же палочку в течение относительно короткого временного промежутка. Но даже в этом случае процесс весьма эффективен, а энергия конечной реакции существенно превосходит энергию, поглощенную зрительным пигментом. Поглощение света инициирует цепь реакций, черпающих энергию из метаболизма. Тем самым зрительное возбуждение является результатом усиления светового сигнала, попадающего в сетчатку. Фоторецептор служит биологическим эквивалентом фотоумножителя, который преобразует кванты света в электрический сигнал с большим усилением и низким шумом (см. гл. 7). И фоторецептор, и фотоумножитель достигают большого коэффициента усиления с помощью каскада стадий усиления. Зрительные пигменты представляют собой интегральные мембранные белки, которые находятся в плазме и мембранах дисков внешнего сегмента фоторецептора. Фотоизомеризация ретиналя вызывает серию конформационных изменений в связанном с ним белке и тем самым образует или раскрывает ферментативный активный центр. Следует каскад ферментативных реакций, которые в конце концов дают нервный импульс. Электрический ответ начинается с кратковременной гиперполяризации, вызванной закрытием нескольких сотен натриевых каналов в плазматической мембране. Таким способом молекулы-посредники (мессенджеры) передают информацию от диска рецептора к мембране плазмы. Вероятным кандидатом на роль мессенджера является богатый энергией циклический фосфат цГМФ (гуанозин-3, 5 -цикломонофосфат), возможно, в сочетании с ионами Са +. Было показано, что катионная проводимость плазматических мембран палочек и колбочек прямо контролируется цГМФ. Таким образом светоиндуцированные структурные изменения диска активируют механизм преобразования, который сам генерирует потенциал, распространяющийся по плазматической мембране. В настоящее время детали механизмов преобразования и усиления продолжают исследоваться. Была предложена схема, основной упор в которой делается на центральную роль фосфодиэстеразы в процессе контроля за кон- [c.241]

Измеряют активность фосфодиэстеразы в присутствии Са + и кальмодулина на профиле элюции фермента при повторной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК. Фракцию с максимальной активностью отбирают для дальнейшего использования в экспериментах. Хранят при температуре -+-4°С. [c.382]

Очистка фосфодиэстеразы из мозга крупного рогатого скота [c.379]

Для удобства проведения эксперимента инкубационную среду разделяют на два равных объема по 100 мкл каждый. Первый объем состоит из смеси буфера, различных добавок и фермента. Второй — так называемая рабочая смесь , состав которой приведен в списке реактивов. Обычно реакцию начинают добавлением раствора 2 в раствор 1. Все компоненты инкубационной среды-берут с учетом последующего разбавления, возникающего при смешивании. Реакцию проводят в термостате при 29 °С. Время реакции определяют по величине процента гидролиза цАМФ в конкретной серии экспериментов. Для достоверности экспериментальных данных необходимо удерживать минимальный гидролиз цАМФ в области 10% и максимальный — в области 70% (расчет процента гидролиза цАМФ в пробе на с. 382). Останавливают реакцию, катализируемую фосфодиэстеразой, кипячением инкубационной смеси в течение 1,5 мин [c.381]

Психостимуляторы оказьшают активирующее влияние на ф-ции мозга, психич. и физ. деятельность. К ним относятся кофеин, фенамин и сиднокарб. Близки к ним по строению пуриновые алкалоиды теобромин и теофиллин, стимулирую-ицие гл. обр. ф-ции сердечно-сосудистой системы. Механизм действия психостимуляторов связывают с ингибированием фермента фосфодиэстеразы н, следовательно, накоплением циклич. аденозинмонофосфата. [c.139]

На основании данных экспериментов определяют изменения в эффективных величинах максимальной скорости гидролиза и константы сродства фермента к субстрату при активации фосфодиэстеразы комплексом КМ—Са +. [c.382]

Ряд других ферментов, катализирующих гидролиз фосфоэфиров, также имеет важное биологическое значение. В их число входят циклические пуриновые фосфодиэстеразы (в настоящее время немногое известно о химических механизмах действия их актив- [c.130]

ДНК-аза яда кобры известна как ингибитор роста опухолевых клеток. Эта же эндонуклеазная ДНК-аза, а также РН1 -аза и экзонуклеазная фосфодиэстераза широко применяются для определения последовательности нуклеотидов в нуклеиновых кислотах и олигонуклеотидах (Zeller, 1966). [c.190]

Одномерной ионообменной ТСХ на полосках PEI-целлюлозы размером 1,2 X 6,5 см удобно отделять сАМР от АМР, напрпмер при исследовании активности сАМР-фосфодиэстеразы [Rangel-Aldao et al., 1978]. Элюцпю можно вести 0,05—0,12 М водным раствором КС1 (концентрацию следует подобрать для данной партии PEI-целлюлозы) в нейтральном буфере. Благодаря циклизации фосфата отрицательный заряд сАМР меньше, чем АМР, и циклофосфат уходит [c.491]

Таким образом, продвигаясь сверху вниз, по картине относительного сдвига пятен непрерывно удлиняющихся на одно звено фрагментов можно расшифровать всю первичную структуру олигонуклеотида. Здесь надо сделать два дополнительных замечания. Во-первых, мы ничего не узнаем таким образом о природе 5 -концевого нуклеотида, но его легко определить рассмотренными ранее методами ТСХ нуклеотидов. Например, после исчерпывающего гидролиза фосфодиэстеразой змеиного яда только этот нуклеотид будет представлен иуклеозиддифосфатом вида pNp. Во-вторых, метод не позволяет обнаружить модифицированные (минорные) нуклеотиды. Их приходится идентифицировать также методами ТСХ нуклеотидов нли нуклеозидов после исчерпывающего ферментативного гидролиза, как описано выше, где, в частности, приводилась и методика, используемая в цитируемой работе. [c.505]

Высокая скорость реакции гидролиза циклических нуклеотидов возможна только в присутствии миллимолярных концентраций Mg +. Вытеснение ионов M.g + другими двухвалентными ионами, в том числе Са +, снижает скорость ферментативной реакции. Длительное время фермент считали гомодимером с м. м.—120 000—130 000 Да, по данным гель-фильтрации. Последними исследованиями показана возможность существования молекулы фосфодиэстеразы в виде двух неидентичных субъединиц с небольшой разницей м. м. 3000—4000 Да. [c.378]

В отсутствие кальмодулина эффективная константа сродства фосфодиэстеразы к цАМФ>200 мкМ, к цГМФ>10 мкМ. [c.378]

Активация фосфодиэстеразы при действии комплекса Са +—КМ сопровождается увеличением величины Vmax от 3 до 50 раз и уменьшением эффективной константы сродства фермента к субстрату не более чем в 5 раз в зависимости от способа очистки и времени хранения фермента. Индуцированную комплексом активность фосфодиэстеразы ингибирует большое число различных по своей химической структуре соединений, известных под общим названием антагонисты кальмодулина (АКМ). К ним, в частности, относятся лекарственные препараты, широко применяемые в медицине. при лечении шизофрении, бронхиальной астмы, злокачественных опухолей и других заболеваний. Взаимодействие антагонистов кальмодулина возможно не только с каль-модулином, но и с фосфодиэстеразой, однако последний эффект обычно не учитывают, так как он появляется при значительно более высоких концентрациях антагонистов, чем первый. Действие этих веществ можно представить следующей упрощенной схемой [c.379]

Комплекс 4Са +—КМ—АКМ утрачивает свойство своего предшественника 4Са +—КМ и не активирует фосфодиэстеразу. Для значительной части антагонистов кальмодулина ингибирование сопровождается эффектом положительной кооперативности, что подтверждает гипотезу многоцентрового связывания этих соединений с комплексом Са +—КМ в процессе ингибирования индуцированной активности фермента. [c.379]

Хроматография на фенил-сефарозе. Разбавленный в два раза буфером Б элюат с ДЭАЭ-ТСК после добавления в него СаСЬ до конечной концентрации 1 мМ наносят на колонку с фенил-сефарозой, предварительно уравновешенную буфером Б, содержащим 1 мМ a l2-Объем колонки 20 мл. Смолу промывают буферным раствором Б, содержащим 0,1 М Na l и 1 мМ СаСЬ до исчезновения показаний оптической плотности при длине волны 280 нм 1иа увикорде) в диапазоне 0,05 опт. ед. Скорость промывки — 1 мл/мин. Элюцию фосфодиэстеразы с фенил-сефарозы проводят буфером В. Скорость элюции— [c.380]

Исследуют влияние трифторниразина и его синтетического аналога W—7 на активность фосфодиэстеразы. В присутствии 50 и 100 нМ кальмодулина определяют зависимость скорости ферментативной реакции от антагонистов кальмодулина в диапазоне концентраций 10 — 10 М. Проводят оценку механизма действия антагонистов кальмодулина на фосфодиэстеразу [c.382]

Хорошо известно, что при увеличении интенсивности света, падающего на сетчатку, ее чувствительность быстро уменьшается. Это может быть обусловлено фосфорилированием какого-то участка молекулы родопсина опсинкиназой, которая специфически действует на выцветший родопсин. По-видимому, фосфорилированный родопсин менее проницаем для Са +, чем нормальный [147]. Кроме того, выцветание родопсина вызывает активацию фосфодиэстеразы, которая особенно эффективно гидролизует циклический (5МР [148]. Таким образом, действие света может вызвать многочисленные вторичные изменения, связанные со снижением концентрации сОМР. [c.67]

Имеются данные, свидетельствующие о прямом действии трииодтиронина на транскрипцию генов [127]. Наблюдалось связывание этого гормона с одним из ядерных белков [127а] он связывается также другими клеточными компонентами [127Ь]. Важное значение имеет способность трииодтиронина стимулировать мобилизацию жиров из жировой ткани. Высказывалось мнение, что этот эффект обусловлен ингибирующим действием гормонов щитовидной железы на связанную с мембраной фосфодиэстеразу циклического АМР [уравнение (7-25)] [128]. [c.147]

Сопряжение Р.б. со всеми указанными ферментами осуществляется через регуляторные белкн (т. наз. G-белки), к-рые способны связывать гуанозинтрифосфат (ГТФ) и гидролизовать его до гуанозиндифосфата. Р.б., активированный биорегулятором, взаимод, со специфич. G-белком и индуцирует Связывание с ним ГТФ, О-белок в комплексе с ГТФ представляет собой активную форму этого белка, к-рая способна взаимод. с одним из эффекторных ферментов (напр., с аденилатциклазой), аллостерически влияя (помимо активного центра фермента) на его активность. При гидролизе ГТФ с участием О-белка последний переходит в неактивную ферму и стимулирующий сигнал затухает. G-Белки, по-видимому, участвуют в преобразовании сигнала, поступающего от больпшнства мембранных Р.б. В частности, сигнал от засвеченного родопсина передается иа исполнит, фермент (фосфодиэстеразу циклич. гуанозинмонофосфата) специфичным для зрительной клетки G-белком-трансдуцином. [c.262]

К А. с. четвертой группы относят специфич. антагонисты медиаторов, препараты, подавляющие общую возбудимость этих тканей, напр, стимуляторы -рецепторов и антагонисты фосфодиэстеразы, расслабляющие гладкую мускулатуру, а также глюкокортикостероиды. Действие последних обусловлено их противовоспалит. св-вами, торможе- [c.171]

Осн. ф-ция К.-активация мн. ферментов аденилатциклазы, фосфодиэстеразы циклич. нуклеотидов, киназы фосфо-рилаз и легких цепей миозина (киназы-ферменты, катализирующие перенос фосфорильной группы с АТФ на субстрат), Са -зависимой протеинкиназы цитоплазмы и мембран, фосфолипазы Aj и др. Благодаря этому он влияет на гликогенолиз и липолиз, секрецию нейромедиаторов, адренергич. передачу регуляторного сигнала, изменяет функциональные св-ва рецепторов, ускоряет активный транспорт Са в сердце и мозге, препятствует гуанозинтрифосфат-зависимой полимеризации тубулина (белок, из к-рого состоят жгутики и реснички клеток животных и растений), влияет на скорость деления клеток. [c.293]

Центральный и периферич. эффекты метилксантинов связывают с внутриклеточным накоплением аденозин-3, 5 -мо-нофосфата, что обусловлено уменьшением распада последнего в связи с угнетающим влиянием препаратов на фосфодиэстеразу. Определенную роль в механизме стимулирующего действия метилксантинов может играть их способность конкурировать с эндогенным аденозином за связывание с его рецепторами в мозге. [c.138]

Na - a -обмена продолжается. Это приводит к активации гуанилатциклазы и частично, по-видимому, к ингибированию фосфодиэстеразы. В результате этого концентрация цГМФ увеличивается и Na -каналы открываются. [c.273]

Механизмы действия миотропных С. с. до конца не выяснены. Предполагают, что эти препараты влияют на биохим. и биофиз. р-ции, сопровождающие мышечное сокращение и регулирующие содержание циклич. нуклеотидов в глад-комышечной клетке, активность фосфодиэстеразы, перемещение ионов N3 , К и Са , образование или выделение из тканевых депо эндохенных биологически активньп в-в (гистамин, серотонин, кинины и др.), изменяющих тонус гладкой мускулатуры сосудов и внутр. органов. [c.391]

Биохимия Том 3 (1980) -- [ c.73 , c.169 , c.172 ]

Молекулярная биология (1990) -- [ c.14 , c.171 ]

Биологическая химия Изд.3 (1998) -- [ c.290 , c.296 , c.403 , c.404 , c.469 ]

Биохимия (2004) -- [ c.137 , c.138 , c.327 ]

Теоретические основы биотехнологии (2003) -- [ c.32 ]

Аффинная хроматография (1980) -- [ c.315 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) -- [ c.793 ]

Биохимия нуклеиновых кислот (1968) -- [ c.72 , c.93 ]

Химия нуклеозидов и нуклеотидов (1966) -- [ c.0 ]

Методы химии белков (1965) -- [ c.231 ]

Начала органической химии Кн 2 Издание 2 (1974) -- [ c.674 ]

Начала органической химии Книга 2 (1970) -- [ c.744 ]

Химия и биология вирусов (1972) -- [ c.177 ]

Биохимия человека Т.2 (1993) -- [ c.10 , c.165 , c.193 , c.194 , c.261 , c.270 , c.271 , c.307 ]

Биохимия человека Том 2 (1993) -- [ c.10 , c.165 , c.193 , c.194 , c.261 , c.270 , c.271 , c.307 ]

Нейрохимия (1996) -- [ c.112 , c.345 , c.346 ]

Введение в биомембранологию (1990) -- [ c.143 , c.149 ]

Биохимия мембран Биоэнергетика Мембранные преобразователи энергии (1989) -- [ c.0 ]

Биологическая химия (2004) -- [ c.214 , c.366 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология