ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ II ТИПА

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ. Узнают определенные короткие последовательности, как правило, в неметилированной ДНК и расщепляют ее иногда в месте связывания, а иногда в каком-либо другом месте (это зависит от типа фермента). [c.527]

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Ферментам рестрикции в клетке всегда сопутствуют идентичные по субстратной специфичности модифицирующие метилазы, защищающие внутриклеточную ДНК от действия сопряженной рестриктазы. Учитывая близкую функциональную взаимосвязанность ферментов рестрикции-модификации следовало бы их рассматривать совместно. Однако, метилтрансферазы этого типа подробно рассмотрены в обзоре, опубликованном в 23 томе серии Молекулярная биология. Итоги науки и техники . [9]. В настоящей работе сведения об модифицирующих метила-зах, являющихся компонентами систем рестрикции-модификации, будут представлены только в той мере, в которой это будет необходимо для характеристики рестриктаз. [c.5]

Часть I. ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ II ТИПА [c.6]

История открытия ферментов рестрикции, детальная характеристика их биологической роли, энзиматических и структурных особенностей детально рассмотрена в большом количестве обзоров [49, 58, 59, 62, 263, 309, 417]. Учитывая направленность настоящего обзора на рассмотрение одного из известных типов рестриктаз, в этом его разделе ограничимся лишь описанием некоторых общих вопросов, призванных в первую очередь определить место специфических эндонуклеаз (рестриктаз II типа) среди других обсуждаемых ферментов. [c.6]

Уже сейчас разнообразие нуклеотидных последовательностей, узнаваемых специфическими нуклеазами, представлено большим числом вариантов. Работа по поиску рестриктаз далеко не завершена. С каждым годом появляются ферменты с новой субстратной специфичностью и пока не видно признаков снижения темпов роста их числа (см. табл. 2). Вариабельность структуры узнаваемых последовательностей в настоящее время уже такова, что кажется вполне вероятным со временем обнаружить рестриктазу для любой последовательности нуклеотидов, по меньшей мере являющейся производным типов, представленных в табл. 8. Интенсивное развитие работ по поиску новых ферментов рестрикции позволяет надеяться, что со временем будет получен ответ и на этот вопрос. [c.41]

II не нуждаются в АТР. Самое удивительное, что места расщепления нуклеазами типа II весьма специфичны. Как уже обсуждалось в одной из предыдущих глав (разд. 24.27), многие из этих ферментов узнают определенную последовательность из 4-6 пар оснований и гидролизуют в каждой цепи единственную строго определенную фосфодиэфирную связь в этой области. Отличительная особенность этих участков расщепления состоит в том, что они симметричны относительно оси вращения второго порядка (рис. 30.18). Ферменты рестрикции - незаменимый инструмент в исследовании структуры ДНК (разд. 24.27) и создании новых молекул ДНК (разд. 31.9). [c.178]

Подобная сложность систем рестрикции I типа привела к предположению о том, что эти ферменты играют в клетках какую-то роль помимо рестрикции. Однако другие функции рестриктаз пока не обнаружены. [c.132]

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями — палиндромами [c.26]

Рис. 34.2. Полифункциональные ферменты типа I содержат различные субъединицы для рестрикции, модификации и узнавания.

В дальнейшем выяснилось, что один и тот же штамм может осуществлять несколько типов рестрикции и модификации. Из клеток, способных к рестрикции, были выделены эндонуклеазы, специфичные к определенным нуклеотидным последовательностям неадекватно модифицированной ДНК. Эти ферменты широко применяются в работах по генной инженерии (см. гл. 11). [c.222]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Становление генной инженерии связано с открытием и использованием специального класса ферментов — специфических эндонуклеаз, или рестриктаз. Ферменты этого типа являются составной частью системы рестрикции — модификации прокариотических клеток. Разл.1чают три основных класса рестриктаз [c.139]

Большинство рестриктаз класса II узнают на ДНК последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, обладающих осью симметрии второго порядка. В 1973 г. американские И1-следователи X. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру для обозначения ферментов системы рестрикции — модификации. В соответствии с этой номенклатурой, которая сегодня является общепринятой, первая буква рода и две первые буквы вида образуют состоящие из трех букв сокращения источника выделения фермента. Эндонуклеазы обозначают символом R, метилазы — М. Если из одного типа клеток выделены два или больше ферментов рестрикции, то их нумеруют соответственно римскими цифрами. Исходя из этой номенклатуры рестриктазы Е. oli [c.139]

Рестриктазы, впервые открытые благодаря их действию nat чужеродную ДНК, попавшую в бактериальную клетку, пред ставляют собой основной рабочий инструмент молекулярного-биолога. К настоящему времени охарактеризованы многочисленные ферменты рестрикции, но наибольшее внимание уделяется ферментам типа II, поскольку именно они узнают определенные последовательности нуклеотидов внутри или окола-сайта их действия и разрезают обе нити двухцепочечной молекулы ДНК определенным образом. Обычно за единицу (ед.) активности рестриктазы принимают активность, при которой- [c.278]

На основании субъединичной структуры и потребности в кофакторах рестриктазы сначала были разделены на два типа [89]. В результате дальнейших исследований появились дополнительные критерии для классификации ферментов рестрикции. Был идентифицирован третий тип специфических эндонуклеаз [201, 307]. Основные свойства ферментов всех трех типов приведены в табл. 1, позаимствованной из обзора Юана [417]. Эта таблица представлена с незначительными дополнениями, касающимися новых сведений о субстратной специфичности сравниваемых ферментов рестрикции, отнесенных к разным типам [212, 292, 293, 319]. Включение в нее данных о модифицирующих метилазах является неизбежным, так как ферменты I и III типов представляют собой бифункциональные сложные белки, проявляющие как рестриктазную, так и ме-тилазную активность [157, 201, 307, 325, 418]. Кроме того, ферменты I типа обладают ярко выраженной АТФазной активностью [134, 418]. [c.8]

Есо57 I напоминает ферменты рестрикции III типа, но отличается от них отсутствием потребности в АТФ. [c.11]

На основе проведенных исследований было предложено рассматривать Gsu I и Есо57 I как представителей новых классификационных типов ферментов рестрикции и отнести их к [c.11]

Чувствительность рестриктаз к различным модификациям субстрата представляет собой важное проявление их специфичности. Поэтому такие данные регулярно обобщаются и публикуются. Выполняется эта работа в основном Макклелландом [252, 253, 258]. В табл. 12 представлены сводные данные, касающиеся характеристики ферментов рестрикции II типа [258]. Они обобщают совокупность известных данных о чувствительности рестриктаз к метилированию субстрата. Ниже приводятся некоторые частные обобщения, составленные на основе данных, приведенных в табл. 12. [c.49]

Методом генетического анализа в исследованных немногочисленных случаях было установлено, что система хозяйской специфичности в случае ферментов И типа контролируется двумя (г и т) генами [64, 413]. Также в этих опытах была показана нежизнеспособность щтаммов с генотипом г+Ш [64, 413], что вполне понятно учитывая функцию метилазного компонента в системе двух сопряженных ферментов. На этом же этапе исследований было установлено, что гены ферментов рестрикции-модификации могут быть локализованы на плазмидах [167, 389]. В настоящее время предполагается, что некоторые гены гт расположены в бактериальных хромосомах [180, 194, 306, 350, 363, 389], хотя строго говоря этот вывод экспериментально подтвержден только в случае BsuR I [375]. Имеется пример фаговой локализации генов, контролирующих структуру ферментов RME oP 1, относящихся к 111-ему типу [184, 351]. В от- [c.100]

Системы рестрикции II типа обнаружены у очень многих бактерий. Эти системы состоят из двух отдельных ферментов, рестриктазы н метилазы, узнающих одну и ту же последовательность ДНК — сайт рестрикции. Если сайт рестрикции не метилирован, то рестриктаза вносит в него двуцепочечный разрыв. ДНК не подвергается рестрикции, если хотя бы одна цепь метилирована. Такие свойства предохраняют собственную ДНК бактерий от рестрикции собственная ДНК либо полностью метилирована по всем сайтам рестрикции, либо, после репликации, патуметилирована. На полуметилированные сайты рестрикции действует метилаза и метилирует их полностью. Как и прочие клеточные метилазы, метилазы системы рестрикции-модификации в качестве донора метильных групп нс-патьзуют 5-аденозилметионин. В табл. 7 для примера приведены данные о некоторых рестриктазах и метилазах II типа. [c.130]

Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся чужеродной именно по типу ее модификации. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрици-рующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах. Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий их сушествование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения. Следует отметить, однако, что присутствие системы модификации и рестрикции не обязательно некоторые бактериальные штаммы утратили ее. [c.431]

Ко второму классу активностей, характеризующих систему рестрикции и модификации отнесены активности ферментов типа I и III. Эти ферменты представляют собой мультимеры и выполняют в клетке как эндонуклео-тическую, так и метилирующую функции. Механизмы их действия отличны друг от друга и от механизма действия ферментов типа II. Точно не известно, у какой части бактерий функционируют системы типа I или III, однако очевидно, что они менее распространены, чем система типа II. [c.433]

Рис. 34.5. Ферменты типа III содержат две субъединицы. Узнавание и метилирование, осуществляемые субъединицей MS, происходят в сайте-мищени событие рестрикции может происходить в соседнем сайте, находящемся в контакте с субъединицей R.

Из различных видов и щтаммов бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты рестрикции. Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых происходит разрез двойной спирали ДНК. В таблице 9.2 приведена их классификация. Функция некоторых из этих ферментов почти наверняка состоит в защите клетки от присутствия чужеродной немодифицированной ДНК. Однако, в клетках некоторых видов бактерий эндонуклеазы рестрикции хотя и присутствуют, тем не менее, они, по-видимому, не ограничивают проникновение чужеродной ДНК in vivo. Вероятно, эти ферменты осуществляют какие-то иные функции. Как бы то ни было, рестриктазы независимо от их функций in vivo служат мощным инструментом структурного анализа геномов. [c.270]

Какого бы типа векторные плазмиды ни использовались, для эффективного инициациирования тракскрипции необходимо, чтобы в их составе присутствовал дрожжевой промотор. Чаще всего используют гликолитические промоторы. Поскольку ферменты гликолиза, несмотря на то что они кодируются уникальными генами, составляют от 1 до 5% суммарного клеточного белка, можно было предположить (и зто оказалось верно), что промоторы соответствующих генов относятся к разряду сильных промоторов. Другое необходимое условие успешной экспрессии — это эффективное терминирование транскрипции. Дрожжевые клетки обычно узнают терминаторные последовательности млекопитающих, однако с точки зрения оптимизации системы имеет смысл ввести в вектор дрожжевой терминатор (рис. 7.1). Промотор и терминатор разделены уникальным сайтом рестрикции, что позволяет реализовать стандартный путь создания рекомбинантной конструкции с интересующим структурным геном. [c.215]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая различные типы прыжков по хромосоме , А — клоны стандартных библиотек, позволяющие осуществлять строго определенные прыжки, начиная от любой точки на хромосоме. Б — два клона специфических библиотек, в данном случае для фермента Они позволяют осуществлять прыжки от одного сайта этого фермента к ближайшему такому же сайту. В — клоны библиотек связок , представляющие собой участк ДНК, которые включают редко встречающиеся сайты рестрикции, в данном случае Л оЛ-сайты. Г — клоны стандартной библиотеки, позволяющие осуществлять прыжки от произвольной точки до ближайшего редкого сайта рестрикции, в данном случае тоже до Л оЛ-сайта.

Системы рестрикции-модификации типа II устроены наиболее просто [74, 75]. В таких системах модифицирующая ДНК-ме-тилтрансфераза функционирует в виде свободного мономера, а эндонуклеаза рестрикции - в виде димера, причем эти два фермента не зависят друг от друга. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, они активны в присутствии ионов Mg2+ без каких-либо дополнительных кофакторов и чаще всего используются при молекулярном клонировании, а также в ДНК-диагностике. [c.50]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология