Мутантный ген эффективность транскрипции

Рис. 16.5. Мутантные гены tk с систематически изменяющимися расстояниями между первой и второй дистальной последовательностями и последовательностью ТАТА, полученные с помощью введения делеций или вставок чужеродных фрагментов в ДНК гена дикого типа. Для каждого мутанта указан размер Удаленного (— ) или встроенного ( + ) фрагмента ДНК в нуклеотидных парах. Справа приведены данные по оценке эффективности транскрипции мутантных генов

Впервые репрессор был получен при выделении из экстрактов клеток Е. соИ компонента, способного связываться с добровольным индуктором ИПТГ. (Поскольку количество репрессора в клетке слишком незначительно, для получения достаточного количества материала необходимо было использовать мутацию промотора, повышающую эффективность транскрипции гена lad, и ввести такой мутантный локус lad в молекулу ДНК, присутствующую в клетке в большом числе копий. В результате удалось увеличить общую продукцию репрессора в 100-1000 раз.) [c.181]

Рис. 16.3. Мутантные гены i/с, полученные, как показано на рис. 16.2. Нормальная последовательность соответствующей области гена tk приведена в верхней строке (показана только последовательность некодирующей цепи). Встраивание в эту последовательность Ват HI-линкера на различных участках приводит к возникновению нуклеотидных замен, выделенных цветом. Эффективность транскрипции для каждого из мутантных генов указана в табл. 16.2 (По M KnightS.L, Kingsbury R., 1982. S ien e 217, 316.)

Таблица 16.2. Эффективность транскрипции мутантных генов tk, показанных на рис. 16.3, в ооцитах Xenopus

Эффективность инактивации белка-репрессора и соответственно активации транскрипции зависит от соотношения между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Если концентрация репрессора слишком велика, то транскрипция не инициируется, и наоборот, если молекул репрессора очень мало (даже при том, что их больше, чем копий промотора), то транскрипция может идти и в отсутствие индукции. Про такие промоторы говорят, что они текут . Чтобы осуществлять строгий контроль таких регулируемых систем, разработаны разные стратегии. Например, ген репрессора и соответствующий промотор помешают в две разные плазмиды, присутствующие в клетке в разном числе копий это позволяет поддерживать нужное соотношение между числом молекул репрессора и числом копий промотора. Обычно ген репрессора находится в малокопийной плазмиде, число ее копий в клетке не превышает 8, а промотор - в мультикопийной плазмиде с 30-100 копиями на клетку. Ген репрессора может быть локализован и в хромосомной ДНК, находясь в ней в единственном числе, что позволяет поддерживать низкую концентрацию репрессора. В системах, использующих /ас-промотор, можно получить /ос-репрессор в значительно большем количестве, если заменить /ас/-ген его мутантной формой /дс/ч, что приводит к уменьшению протекания промотора, т. е. к снижению уровня транскрипции клонированного гена без индуктора. [c.108]

Какова природа вещества (апорепрессора), синтез которого контролируется геном I Недавние эксперименты показали, что Ьас-репрессор представляет собой белок, способный специфически взаимодействовать с Ьас-онераторным участком в ДНК. Функция репрессора заключается в блокировании транскрипции. Удаление ренрессора (обычно в результате взаимодействия с индуктором) инициирует транскрипцию. Участок, служащий началом координированного синтеза т-РНК, расположен рядом с операторным участком и носит название промотора (р) В результате мутации гена I образуются мутантные репрессоры различных типов I"-штаммы либо вообще не синтезируют ас-ренрессора, либо синтезируют дефектный репрессор, не способный блокировать транскрипцию ас-оперона 1 -штаммы синтезируют молекулы репрессора, не способные эффективно взаимодействовать с индуктором, вследствие чего в этих клетках Ьас-оперон выключен всегда — как в отсутствие индуктора, так и в его присутствии наконец, [ -штаммы синтезируют репрессор, которому для соединения с оператором необходим индуктор. У этих штаммов ферменты -оперона синтезируются в отсутствие индуктора, а введение индуктора в среду ингибирует их синтез. [c.537]

При анализе всех этих вопросов необходимо помнить, что усиливающие и ослабляющие мутации определяются относительно обычной эффективности, с которой работает промотор. Эффективность различных промоторов варьирует в широких пределах. Поэтому изменения, выявляемые как ослабляющие транскрипцию в одном промоторе, в другом могут быть не обнаружены, причем такой промотор даже в отсутствие мутаций может быть менее эффективен, чем мутантная форма промотора первого типа. Поэтому для определения истинного эффекта этих мутаций необходимо проводить исследования in vitro, что дает возможность изучать сродство РНК-полимеразы к различным промоторам дикого и мутантного типов в одинаковых условиях. In vitro наблюдаются приблизительно стократные различия в степени сродства РНК-полимеразы к различным промоторам. Этот разброс коррелирует с частотой транскрипции многочисленных генов in vivo. [c.146]

Для идентификации в 5 -фланкирующей последовательности нуклеотидов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена tk, можно было бы вводить мутации в каждое положение. Такой подход оказался бы чрезвычайно трудоемким. Более эффективный метод, названный лин-керным сканированием, был использован в работе Мак-Найта и его коллег. Этот метод (рис. 16.2) включает создание в клонированном гене tk двух наборов делеций-с левого и с правого конца клонированной последовательности. Протяженность делеции в каждом делеционном варианте фиксировали с помощью определения нуклеотидной последовательности. Были получены 43 различные делеции с 5 -конца и 42-с З -конца, вошедшие в состав мутагенизированных таким образом генов tk (рис. 16.2). С использованием подходящих делеционных мутантов из каждого набора можно было сконструировать гены, содержаище мутации замещения и отличающиеся от нормальной последовательности tk в десяти или менее положениях нуклеотидных пар. Некоторые из этих мутантных последовательностей показаны на рис. 16.3. [c.212]

Энхансер Р-глобина курицы расположен позади транскрипционной единицы Р-глобина. В последовательных поколениях эритроцитов (и только в них), он образует гиперчувствительный к нуклеазе сайт. Этот факт свидетельствует о том, что в эритроцитах с энхансером связаны белки-регуляторы. Для того чтобы ггдентифицировать их, следует определить, какая именно последовательность нуклеотидов необходима для проявления активности энхансера. Для этого мутантные последовательности энхансера объединяли с маркерным геном. Продукт такого гена легко определить это дает возможность судить о влиянии любой мутации энхансера на транскрипцию каждую рекомбинантную конструкцию вводили в эритроциты курицы и регистрировали эффективность экспрессии гена-маркера (рис 10-20). Те нуклеотиды, которые при таком тестировании оказываются необходимыми для активности энхансера, можно считать участками связывания специфических белков. С помогцью данной методики было установлено, что тагсих белков-три (рис. 10-21). Содержание каждого из них в клетке очень мало, но благодаря гому, что сайты их связывания известны, можно клонировать кодируюгпие последовательности ДНК и, следовательно, получать эти регуляторные белки в неограниченном количестве (см. разд. 9.1.7). [c.193]

Если желаемым продуктом является выделяемый клеткой фермент (чаще всего это гидролитические ферменты, хотя в последнее время большой интерес проявляется и к ряду оксидоре-дуктаз, в частности, участвующих в катаболизме аминокислот), то мутации, способствующие усилению его образования и активности, а также накоплению в среде, могут затрагивать 1) структурный ген, приводя к синтезу мутантного фермента, не чувствительного к ингибированию конечным продуктом реакции, и (или) повышая его активность (число оборотов, т. е. число молей превращаемого субстрата в минуту) мутация в промоторной части гена должна усилить частоту инициации транскрипции или вызвать конститутивный синтез фермента 2) гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции синтеза данного фермецта (в частности, по типу катаболитной репрессии, имеющей разнообразные формы проявления и в общем виде выражающейся в обратной зависимости синтеза катаболитчувствительного фермента от скорости роста клеток), мутации в этих генах должны устранить или ослабить факторы, ограничивающие синтез фермента 3) гены, кодирующие ферменты, которые могут гидролизовать и инактивировать нужный фермент, мутации должны уменьшить или устранить такую возможность 4) гены, ответственные за синтез компонентов клеточных мембран, которые участвуют в сборке (у эукариотов) и экскреции ферментов, мутации в этих генах могут повысить эффективность указанных процессов. [c.79]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология